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干细胞解禁,你准备好了吗?[选购宝典]

【字体: 时间:2009年04月16日 来源:生物通

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  2009年3月9日,美国总统奥巴马在白宫签署行政命令,宣布解除对用联邦政府资金支持胚胎干细胞研究的限制。历时8年之久,干细胞终于解禁了。可是,你是否已经准备好了,来对付这些挑剔的家伙?

2009年3月9日,美国总统奥巴马在白宫签署行政命令,宣布解除对用联邦政府资金支持胚胎干细胞研究的限制。而在1月,加州一家小型生物技术公司——杰龙公司得到了美国FDA的批准,将开始首次使用人胚胎干细胞(hESC)来治疗因脊柱受损而导致截瘫患者的临床试验。历时8年之久,干细胞终于解禁了。美国学者为之欢欣鼓舞,而中国学者也不禁快马加鞭,恐为人后。

然而,hESC的研究仍面临巨大的挑战,其中最关键的是干细胞的培养试剂。地球人都知道,干细胞的培养可不像普通的永生化细胞那么简单。它们具有多能性,必须维持其未分化的状态。而且干细胞很挑剔,长得过密,或培养条件略有不同,这些家伙就会开始分化。因此,干细胞需要你每天精心的呵护。

起初,hESC是在滋养层细胞(通常是小鼠胚胎成纤维细胞,MEF)上生长,且培养基中添加了胎牛血清和生长因子。这样的条件带来了两个问题。第一,生长培养基的组成是一个黑盒子,你不清楚里面有什么,而且血清和MEF的批次间差异永远无法避免。其次,这些成分不明、动物来源成分的使用将会为未来监管带来问题,阻碍了胚胎干细胞的临床应用。因此,开发出成分完全确定、无动物来源成分的培养基是相当必要的。

现在市场上涌现出许多hESC特异的培养基,包括:Invitrogen的STEMPRO hESC SFM(无血清、无滋养层的培养基)、Millipore的HEScGRO、STEMCELL的mTeSR 1等等。许多是完全确定的,不需要血清,有些还能实现无滋养层的生长。mTeSR 1还能支持iPS细胞的生长,据STEMCELL公司多能干细胞的高级产品经理Clive Glover介绍,WiCell的iPS细胞库就完全使用了mTeSR 1来维持。

在血清方面,国内有很多干细胞研究人员使用了Invitrogen的KnockOut血清替代物(大家通常简称为KnockOut SR)来替代胎牛血清。KnockOut SR是维持未分化hESC同时保留细胞多能性的金标准试剂,目前全球80%的hESC实验室正在使用它。今年初,Invitrogen在KnockOut SR的基础之上,新推出了第一款无异源成分的血清替代物—KnockOut SR XenoFree。其中所有的动物蛋白都被去除,更适合于临床的研究。

光是培养基和血清还不够,加利福尼亚大学hESC核心设施的主管Karl Willert除了从Invitrogen采购Knockout SR和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)外,还向培养基中添加了人血清白蛋白(购自拜耳)。他觉得FGF的费用是培养hESC的主要消耗,“你必须天天喂养细胞,每天加入新鲜的FGF”。

此外,滋养层细胞在hESC培养中也扮演了双重角色。它们同时提供了生长底物和生长因子。后者我们能用外源的生长因子来替代。至于前者,一些研究人员也开始用基底膜替代物来取代,如BD的Matrigel或Invitrogen的Geltrex。Invitrogen同时提供无外源的CELLstart 底物。

在培养的过程中,我们既要评估hESC培养物的多能性,又要随时注意有无分化的倾向。BD公司就提供了一个荧光标记抗体试剂盒,针对TRA-1-81,SSEA-1和SSEA。前两个是多能性的标志物,后者是分化的标志物。利用这个试剂盒,研究人员既能评估hESC培养物的多能性程度,还能在细胞分选仪的帮助下富集多能(或分化)的细胞。Millipore的FlowCellect hESC表面标志物鉴定试剂盒也根据HESCA1、SSEA1和SSEA4的表达,进行类似的分析。

此外,研究人员也可以通过RT-PCR来评估干细胞的特性,如Invitrogen的StemPro EZChek多重PCR试剂盒,包含了测定Oct4(多能标志物)、AFP、ACTC1和Sox1(分别为内胚层、中胚层和外胚层的标志物)及GAPDH(内参)表达的多重分析。

如果你想让hESC分化,可以试试STEMCELL的AggreWell板。AggreWell板试图用一种方法来统一hESC分化,将细胞簇从培养皿上手工刮下来,并进行悬浮培养。AggreWell板从本质上说就是一种修饰的24孔板,孔中包含了1200个微小的倒置微孔,能捕获单个hESC或hiPSC,并将它们培养成单个拟胚体。hESC和iPSC的分化都需要拟胚体的形成。Glover称这个过程不比传统方法更快,但能控制拟胚体的大小,减少分化的可变性。

在干细胞的功能分析方面,赛默飞世尔科技应该能满足你的需求。它通过Dharmacon和Open Biosystems两大产品线,提供了siRNA、shRNA、cDNA、ORF、microRNA抑制剂和microRNA模拟物的文库,来提高或降低细胞中几乎所有基因或调节性RNA的表达。此外,赛默飞世尔的Pierce和Abgene产品线也提供了通过抗体和PCR检测分化标志物的方法。

赛默飞世尔科技基因组集团的研发主管Devin Leake通过一个间充质干细胞(MSC)的例子来解释这些工具的用途。他说道:“通过使用miRNA抑制剂或模拟物,我们发现了3个microRNA能诱导MSC分化成骨细胞。利用microRNA来控制干细胞分化,让研究人员能更好地研究分化过程及骨细胞生物学。”

为了将核酸导入干细胞,研究人员有几个选择。他们能利用慢病毒载体(详见生物通2008技术点评:慢病毒载体)、化学的转染试剂(比如鼎鼎大名的Lipofectamine或Fugene系列)或电穿孔(例如BioRad的电穿孔仪或amaxa的Nucleofector)。另外,Invitrogen最近也刚推出一款电穿孔仪-Neon System,适于干细胞的转染,使用也很简单。赛默飞世尔的Accell siRNA则更牛,无需借助任何仪器或试剂,自行进入细胞。

最后谈到hESC的冻存,研究人员也有一些选择,包括STEMCELL的mFreSR 冻存培养基。mFreSR是成分完全确定,不需要添加血清的培养基,对于无血清培养干细胞的用户来说是一个好选择。“如果你想完全排除不确定的成分,那么最好不要在血清中冻存。”Glover解释道。

尽管越来越多的新产品在涌现,hESC的研究人员仍在为许多关键的问题而头疼,包括标准的培养条件、分化成目标细胞类型的步骤及报告细胞系。要解决这些问题,干细胞研究人员任重而道远。

(生物通 余亮)

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