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形形色色的凋亡检测[选购宝典]

【字体: 时间:2009年05月04日 来源:生物通

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  随着凋亡检测工具的日益丰富,我们能利用显微镜、酶标仪、流式细胞仪和发光检测仪等各种各样的工具来检测各种细胞中的凋亡。检测的参数也是五花八门,有caspase、磷脂酰丝氨酸、线粒体膜电位、DNA片断化、细胞色素c等等,令人目不暇接。虽然可供选择的方法很多,但没有一种是放之四海而皆准的,每一种都有优点和缺点。因此,在选择凋亡检测方法时,了解每种分析的优缺点很关键。

以前,我们只关心细胞是死是活。现在,研究者的兴趣已不再局限于此,大家更关心细胞到底是怎么死的,哪条通路受到了影响,观察到的是凋亡的哪个阶段,甚至如何阻止它。

既然凋亡是一个相当复杂的信号级联,那么我们就有很多机会来评估参与其中的蛋白活性。随着凋亡相关蛋白的不断发现,我们也有了越来越多的检测对象。然而,凋亡和坏死的许多特征相互重叠,即使是福尔摩斯也难以分辨,因此有必要采用两种或更多不同的方法来验证细胞的死亡方式。一种检测早期凋亡事件,而另一种则瞄准晚期事件。多重分析现在也变得越来越普及,它能从同一个样品中获得两组或以上的数据。虽然可供选择的方法很多,但没有一种是放之四海而皆准的,每一种都有优点和缺点。因此,在选择凋亡检测方法时,了解每种分析的优缺点很关键。

了解每个模式系统中细胞死亡的动力学同样很关键。某些蛋白,如caspase,表达的时间很短暂。正在经历凋亡的体外培养细胞,最终也必然会经历坏死。而且凋亡细胞会很快地死亡并消失。凋亡从开始到结束一共才2-3小时。因此,如果分析得太早或太晚,就难免出现假阴性。此外,凋亡可能以很低的频率出现,或只是出现在器官、组织中的特定位点。在这种情况下,快速地通览全局就很有用。总的来说,如果你需要细胞死亡机制的详细信息,那么毒素暴露的时间、待测化合物的浓度以及分析终点的选择就变得很重要。

随着凋亡检测工具的日益丰富,我们能利用显微镜、酶标仪、流式细胞仪和发光检测仪等各种各样的工具来检测各种细胞中的凋亡。检测的参数也是五花八门,有caspase、磷脂酰丝氨酸、线粒体膜电位、DNA片断化、细胞色素c等等,令人目不暇接。一般来说,凋亡检测可分为5大类:

  1. 细胞形态学的改变
  2. 细胞膜的改变
  3. DNA片断化
  4. Caspase的检测
  5. 线粒体的分析

细胞形态学的改变

在正常情况下,活性染料不能进入具有完整细胞膜的细胞,当细胞发生晚期凋亡或坏死时,膜结构被破坏,这些染料就可以进入细胞,故利用活性染料可以评价细胞膜的完整性。任何活细胞/死细胞分析试剂盒,如台盼蓝或碘化丙啶(PI)都能挑出已经凋亡及坏死的细胞。不过,那些正在经历凋亡的细胞还能阻止这些染料进入,因此不会被挑选出。那么,这些分析就要与其他检测凋亡的分析来共同印证。

细胞膜的改变

细胞膜的重排发生在凋亡的早期。在许多凋亡细胞中,这种重排导致磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。这一事件可通过Annexin V的染色来检测。Annexin V是一种Ca 2+依赖的磷脂结合蛋白,在Ca 2+存在的情况下,与PS有很高的亲和力,可与凋亡细胞膜上外翻的PS相结合。荧光(如GFP、FITC)标记的Annexin V一旦与凋亡细胞结合,就可以通过荧光显微镜观察到。这种方法的特点是灵敏,能检测单个凋亡细胞。但是坏死细胞的膜也会被标记上。因此,对于PS阳性的细胞,一定要验证膜的完整性。很多公司都提供了双重染色的试剂盒,来同时评估膜的完整性和PS外翻。但是也有一些例外需要注意。目前已知有些细胞类型在细胞表面组成型表达PS,因此Annexin V染色有可能导致假阳性的结果。

DNA片断化

DNA片断化是凋亡晚期的一个重要特征。普通的琼脂糖凝胶电泳就能检测DNA的片断化。我们可将DNA提取出来,进行电泳。凋亡细胞就会产生阶梯状的电泳条带,间隔大约是180 bp。这种方法简单易行,灵敏度约为1×106个细胞,对于凋亡细胞数量多的实验来说很有用。但换句话说,如果凋亡细胞的数量少,就不推荐使用了。而且并非所有发生凋亡的细胞(如神经细胞、肝细胞、胚胎成纤维细胞)都会检测到DNA ladder。另外,DNA片断化发生在凋亡的晚期,如果你没有检测到DNA片断化,那也不排除细胞正处于凋亡的早期。

目前更为常用的DNA片断化检测方法是TUNEL法。脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)将生物素或荧光标记的dUTP加在DNA片断的3’末端,并通过一定的显色系统使之显示出来。很多公司都提供TUNEL检测试剂盒。这种方法较电泳法来说更为灵敏,荧光显微镜能检测到单个细胞,流式细胞仪也能检测约100个细胞。这种方法也很快,3小时内能完成。但它的费用也比电泳法高不少,而且可能会存在坏死细胞或其它细胞的假阳性。基于这些理由,我们还需要另外一种分析。

Caspase的检测

无论是内部途径,还是外部途径,最终都汇集caspase上,因此caspase成为凋亡检测的大热门。市场上有很多caspase检测试剂盒,来检测多种caspase的活性。我们可以通过荧光标记的底物来检测有活性的caspase,也可以利用荧光标记的caspase抑制剂来标记。你也可以通过免疫组化分析来检测切割的底物如PARP。当然,很多公司也有caspase的抗体。这些方法都能够快速定量凋亡细胞。但是有些方法需要裂解细胞,释放出caspase,这样就不能在组织中定位凋亡事件。此外,另一个缺点是caspase的激活并不是一定表明凋亡的发生。而且,caspase家族成员在底物偏爱性上有着很大的重叠,影响了分析的特异性。

如果你想要评估待测样品与对照之间基因表达的差异,就可以考虑芯片。芯片是一种相对较新的凋亡检测方法,它能够同时描绘出凋亡中多种蛋白的表达差异。我们通过芯片能绘制出编码配体、受体、细胞内调节器及转录因子的基因表达图谱。参与了抗凋亡的基因也能用这种方法评估。

线粒体的分析

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。目前比较流行的分析方法是染料法。通过阳离子染料在线粒体的聚集来检测线粒体膜电位。常用的染料有JC-1。在线粒体膜电位较高时,JC-1聚集在线粒体的基质中,形成聚合物,产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体,产生绿色荧光。这样就可以很方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。但是,这些染料并不能说明细胞凋亡的机制,应与其他凋亡检测方法如caspase分析共同使用。

在活细胞和固定细胞中,从线粒体中释放的细胞色素c能利用荧光和电子显微镜来分析。不过,细胞色素c一旦释放到细胞质中,就变得不稳定。因此,我们必须使用非凋亡的对照,来确保染色条件能够检测任何细胞色素c。

凋亡检测领域仍在不断发展,将来可能会出现更多更快速的检测方法。但正如本文所强调的,我们必须采用两种或以上的方法来验证细胞的死亡方式,这样,我们的结论才更有说服力。究竟是自杀还是他杀,我们要给细胞一个说法!

(生物通 余亮)

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