剑桥大学发表利用SOLiD进行单细胞转录组分析的新方法

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2009年05月13日 来源:生物通

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  剑桥大学以及美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)的研究人员近日发表了一篇利用mRNA测序对单细胞的全转录组进行分析的论文。该论文今天发表于《Nature Methods》(《自然-方法》)在线版。(ABI供稿,生物通翻译)

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纽约(GenomeWeb消息)- 剑桥大学以及美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)的研究人员近日发表了一篇利用mRNA测序对单细胞的全转录组进行分析的论文。该论文今天发表于《Nature Methods》(《自然-方法》)在线版。

通过修改现有的单细胞DNA扩增方法,研究小组解决了利用美国应用生物系统公司的SOLiD测序对单个细胞进行数字化的基因表达分析。当他们将此方法应用于单个小鼠卵裂球时,研究人员发现他们可以测定几乎所有芯片技术所能检测到的基因的表达,此外还包括芯片未能检测到的近5200个基因。该方法还揭示了1800个以前未曾检测到的剪接点。

利用同样的方法,研究人员发现在缺乏Dicer或Ago2(二者均为microRNA加工机制的元件)的小鼠卵细胞中上千个基因的表达上调或下调。

文章的第一作者,剑桥大学的研究人员Azim Surani 与他的合作者们表示:“这种单细胞mRNA-测序分析方法将大大增强我们在研究哺乳动物发育过程中----尤其是胚胎发育早期和干细胞这种体内稀有群体中-----对单个细胞中转录组复杂度的分析能力。”

文章作者提到,高通量转录组测序方法在过去就已开发,但是需要相当大量的RNA,这就需要从多个细胞中收集。而且这种合并的分析不能反映单个细胞中发生的事件,或许那才是生物相关的。

《GenomeWeb每日新闻》的姐妹刊物《测序》在去年11月报道过,Surani和他的同事们通过选择性扩增带有polyA尾巴的RNA来解决这个问题----这种方法在挑出mRNA的同时也挑出了一些非编码RNA。他们还略微调整了构建RNA文库的方法以改善其重复性,然后才进行RNA测序、以及将读数定位于小鼠RefSeq数据库的转录本。

在今天发表的研究中,研究小组在单个的小鼠卵裂球中检验了mRNA-Seq方法,卵裂球是胚胎干细胞的前体,可从小鼠胚胎的四细胞期中分离。然后他们将上万个35-50 bp的读数定位于已知的RefSeq转录本上。

他们的结果与之前研究人员利用Affymetrix芯片检测80个四细胞期小鼠胚胎混合物的表达结果非常相似。对于芯片所鉴定的94%以上的基因,用测序方法都可检测到五个或更多的读数。

此外作者还提到了mRNA-Seq方法还发现了5270个芯片未检测到的基因,其中包括1000多个芯片上还没有探针可供检测的转录本。

尽管芯片分析还检测出了近400个mRNA-Seq所未能发现的基因,但研究小组通过实时定量PCR进行的后续分析表明,这些基因中的大多数是假阳性,或只是在芯片所评估的混合胚胎中的个别胚胎中表达。

Surani及合作者们表示:“也有可能是某些低表达的基因,它们的表达可能在单细胞中随机开启或关闭,而在我们用mRNA-Seq分析的单个细胞中这些基因或许未表达。”

随后的实验显示mRNA-Seq检测到多个已知在胚胎发育中发挥作用的基因的表达。

当研究人员聚焦于单个卵裂球中获得的50 bp数据时,他们发现了数千个新的剪切拼接:约6700个拼接由至少两个读数代表,而1753个由五个或更多的读数代表。在卵裂球中,研究人员还检测到大约19%的表达基因有着两种以上的不同转录本。

在单个的成熟小鼠卵母细胞或卵细胞中,研究小组发现了有着两个以上读数的约9000个剪接,以及有着五个以上读数的近2100个剪接。

接着,研究小组利用mRNA-Seq方法来研究缺乏Dicer或Ago2的小鼠卵细胞中的基因表达情况与野生型的卵母细胞相比之下的变化----Dicer和Ago2是microRNA加工机制中的元件。

他们发现,在缺乏Dicer的卵母细胞中,有1696个转录本上调。在缺乏Ago2的卵母细胞中,1553个基因上调,其中619个在Dicer突变体中表达也明显升高。Dicer或Ago2的敲除分别导致1571或1121个基因的表达下降,其中589个基因在两种突变体中都下调。

尽管研究小组极力赞扬新的mRNA-Seq方法是测量基因表达和发现新剪接异构体的新方法,无偏向性的同时背景噪音也极低,但他们也承认仍存在着局限。

例如,他们提到由于采用了poly(T)引物,目前的mRNA-Seq方法只能检测带有poly(A)尾巴的转录本,这样就错过了组蛋白和其他mRNA。他们还提到此方法不能检测3000个碱基以上的mRNA的5’端,也不能分辨正义链和反义转录本。

(ABI供稿,生物通翻译)

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