凋亡检测之默克篇[选购宝典]

默克旗下的Calbiochem品牌一直以抑制剂及各类生化试剂闻名，殊不知它在凋亡方面也有着很全面的产品。在凋亡的每一个阶段，Calbiochem都有相应的产品提供。其中更是不乏像QIA33和QIA39这样的明星产品。且听生物通一一道来。

一说起默克，大家首先想到的可能是默克医药，但是我们要说的是默克化工。百年之前，他们曾是同一家公司，但自从一战后分家，两个默克除了名字相同，再也没有任何关系。为了不让大家混淆，默克化工在北美地区的业务以EMD的名义开展，在其他地区则为MERCK。因此我们经常在文献中看到EMD，其实这就是默克。默克的产品线很广，除了我们知晓的生化产品，很多日常生活品中都用了默克的化工产品，如家喻户晓的六神花露水，其中含有的IR3535驱蚊剂就是默克生产的。在西安秦始皇陵兵马俑的色彩保护中，默克的高纯度试剂更是功不可没。世界上第一个维生素C也是来自默克。

言归正传，今天我们要讨论的是默克的凋亡检测产品。默克旗下的Calbiochem品牌一直以抑制剂及各类生化试剂闻名，殊不知它在凋亡方面也有着很全面的产品。在凋亡的每一个阶段，Calbiochem都有相应的产品提供。下面生物通就来一一介绍。

凋亡的激活

Calbiochem提供了多种特异性凋亡激活剂，如Fas、TRAIL、TNFa等。此外，它还提供了更多的化学诱导剂，如放线菌素D、A23187、Doxorubcin等。

凋亡线粒体改变的检测

线粒体膜电位降低是细胞凋亡后最早发生的胞内事件。MitoCapture Apoptosis Detection Kit用一种基于荧光的简便方法来区分正常细胞和凋亡细胞。它的基本原理如下：MitoCapture是一种阳离子型染料。在正常细胞中，它可在线粒体中积累并聚合，其聚合体发红色荧光；在凋亡细胞中，由于线粒体膜电位的改变，它不能在线粒体中积累并以单体形式存在于胞浆中，其单体发绿色荧光。因此很容易通过荧光显微镜来区分，也能用流式细胞仪进行定量检测。

线粒体的改变还涉及到多种蛋白，包括著名的Bcl-2家族、细胞色素c、AIF等。Calbiochem提供了几十种抗体，来检测这些蛋白。对于细胞色素c的检测，除了有抗体和ELISA试剂盒外，Cytochrome c Release Apoptosis Assay Kit还提供了独特的试剂，从胞浆中富集线粒体组分，然后通过WB检测可观察到细胞色素c从线粒体到胞浆的转位。

Caspase的检测

Caspase的活化是凋亡的典型特征。Calbiochem提供了两种方法，来检测caspase的活性。一种是基于底物的检测试剂盒。通过荧光素（AFC、AMC）标记的底物或发色团（pNA）标记底物来检测细胞裂解液中caspase活性。当活化的caspase降解标记的底物多肽后，发色团或荧光素被释放出来，引起显色或发光反应，并由相应的仪器检测。一般说来，荧光底物更灵敏，但需要特殊的仪器。而发色底物通过分光光度计或酶标仪就能检测。

另一种是利用带荧光素（如FITC）标记的抑制剂来检测活化的caspase。抑制剂包括一段特异的caspase识别序列，其上连接一个功能基团如醛基（CHO）、氯甲基（CMK）或氟甲基（FMK），能以可逆或不可逆的方式结合到caspase的活性部位。C端连接的化学基团决定了caspase抑制剂可逆与否。一般而言，带CHO基团的caspase抑制剂是可逆的，而CMK、FMK或FAOM基团能与caspase间形成共价键，故这类基团的caspase抑制剂能不可逆地抑制caspase活性，其中带FMK基团的抑制剂特异性更好。

Calbiochem提供了50多种caspase抑制剂，其中最热销的是Caspase Inhibitor I【Z-VAD(Ome)-FMK】，它具有细胞通透性，是广谱的caspase抑制剂，能抑制所有的caspase，但不能抑制纯化的caspase。而Caspase Inhibitor VI（Z-VAD-FMK）也是畅销产品之一，它的细胞通透性虽然不如Inhibitor I好，但可以抑制纯化的caspase。

凋亡细胞膜改变的检测

细胞凋亡中，最早改变的是细胞膜。在正常活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜内侧，一旦细胞发生凋亡，可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。PS的转位发生在凋亡的早期阶段，体内的吞噬细胞可通过识别磷脂酰丝氨酸来清除凋亡细胞，不伴随局部的炎症反应。

Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，在Ca2+存在的情况下，与PS有很高的亲和力，可与凋亡细胞膜上外翻的PS相结合，因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。当Annexin V被荧光素标记时，可经流式细胞仪或荧光显微镜检测到早期凋亡的细胞。

Calbiochem的Annexin V 试剂盒中特有的RAPID™ Media Binding Reagent可直接将AnnexinV-FITC快速标记于培养液中的细胞上，避免了额外的离心、清洗等可能造成细胞膜机械性破坏的操作，从而减少假阳性实验结果的可能，并缩短操作时间。此外，一旦细胞离开培养环境，细胞凋亡即成为渐进性的动态过程，会持续于整个实验操作，过于繁琐的操作步骤往往会错过检测早期凋亡的最佳时间，RAPID™ Media Binding Reagent能简化操作，在检测早期凋亡细胞中的优势凸显。

凋亡细胞核改变的检测

DNA片断化是凋亡的一个重要特点。提起DNA片断化的检测，大家自然会联想到TUNEL。TUNEL技术的原理是染色体DNA断裂时产生大量的粘性3’-OH末端，而生物素或荧光素标记的dNTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下掺入到DNA的3’-末端，并通过一定的显色系统使之显示出来。

说到这里，Calbiochem的两个明星产品就要闪亮登场了。它们都是FragEL DNA片断化检测试剂盒，只是显色方法有所不同，一种是显色法（目录号：QIA33），另一种是荧光法（目录号：QIA39）。这两个试剂盒在凋亡用户中口碑极佳，也常年占据Calbiochem的Top 10销售排行榜，非常值得推荐。试剂盒中的组分齐全，含阳性及阴性对照片、蛋白酶K、显色系统等，即买即用，无需再准备其他试剂。而且QIA33试剂盒还提供中文说明书，使用起来极为方便。

此外，Calbiochem还新推出了BrdU版的TUNEL试剂盒——Apo-BrdU Kit。此试剂盒中，Br-dUTP取代了生物素或荧光素标记的dNTP，在TdT酶的作用下掺入到凋亡DNA片段的3’-末端。因为溴分子比荧光素、生物素或地高辛标记等标记物要小得多，因此Br-dUTP更容易掺入凋亡细胞的DNA片断中，而最后的检测信号也更强。同时，试剂盒还提供流式细胞仪阳性和阴性对照。

除了上文所介绍的，默克的细胞凋亡产品还有很多，据粗略统计，共有五、六十种之多，本文当然也不可能一一介绍。要在这么多种产品中选择最合适的产品，估计你又开始犯愁了。其实非常简单，默克有一份很清晰的凋亡检测试剂盒选择指南，你可以根据样本类型、检测对象、所需设备和凋亡阶段来轻松选择。默克还特别制作了一本中文版的《凋亡研究实用工具及技巧》，除了包含选择指南，还有详细的操作步骤，Q&A等等，很实用，而且在实验室中非常抢手。如果你正在或将要进行凋亡研究，那就赶快点击索取吧。

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（生物通 余亮）