不同亲和层析介质捕获技术及优化策略[创新技巧]

本文节选自GE Healthcare 《BioProcess Newsletter》2009年第三期的《抗体生产纯化》，综合介绍了Protein A Sepharose、Protein G Sepharose、MabSelect、MabSelect Xtra、Mabselect Sure等多种亲和层析介质的特点和应用。

作者：苗景赟 孙文改   通用电气（中国）医疗集团

1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合

目前，约70-80%的抗体纯化使用Protein A、Protein G 亲和层析。蛋白A (Protein A) 来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域。蛋白A作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，一步亲和层析就可达到超过95%的纯度。1个蛋白A分子至少可以结合2个IgG。蛋白A也可以结合另一些免疫球蛋白，如用于某些种属的IgA、IgM的纯化。

天然 (Native Protein A) 和重组的蛋白A (rProtein A) 对于IgG的Fc段有着相似的特异结合。重组的蛋白A经改造后含有一个C末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖上，降低了空间位阻，增加了与IgG 的结合能力。蛋白A 与IgG的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，而其动态结合能力则决定于结合强度 (解离常数) 及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间)。

2 Protein G Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合

蛋白G是一种源自链球菌G族的细胞表面蛋白，为三型Fc受体。其通过类似于蛋白A 的非免疫机制与抗体的Fc段结合。像蛋白A 一样，蛋白G可以与IgG的Fc 区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的IgG, 多克隆IgG及人IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，蛋白G还可以和某些抗体的Fab 和F (ab’)2 段结合。

3 Protein A 、Protein G 亲和层析方法优化

由于不同抗体与蛋白A或蛋白G的亲和力不同，有必要单独优化结合和洗脱条件和层析柱载量，层析条件优化的过程可以通过用自动化层析系统如AKTA 来自动快速完成。以下是一个杂交瘤细胞培养小鼠单抗的纯化条件探索。

4 MabSelect ——大规模抗体纯化新型蛋白A亲和层析介质

MabSelect 是第一个使用高流速琼脂糖凝胶 ( High flow Agarose) 作为骨架的新型蛋白A层析介质，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成为单抗纯化和放大的标准介质。

Mabselect 的特点包括：

a. 高流速琼脂糖作为骨架: 介质的刚性和传质性能大大优于传统的Sepharose 4FF 和6FF 琼脂糖骨架，可以在大规模生产时，使用更高的流速而保持更高的载量，大大提高生产效率。

b. 更高的流速和动态载量：蛋白A 经基因工程改造，C 端含一个半胱氨酸，形成一个定向的硫酯键，同时增加了对IgG的有效结合。蛋白A 和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为500cm/hr 和柱床高度为20cm (停留时间2.4min) 的条件下，每毫升MabSelect 的动态载量可以达到>30mg IgG。在纯化特性(杂蛋白去除、产品纯度等) 方面明显优于其它的蛋白A亲和介质。

c. 更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：和传统的rProteinA FF 介质相同，Mabselect 介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和DNA 更少，有利于后期抗体的精细纯化。
著名的抗体生产商IDEC公司以及R. Hahn的研究显示，Mabselect 对CHO 细胞CHOP (宿主蛋白) 的吸附比其它蛋白A 介质如Prosep A 低7倍。
Robert L. Fahrner 等对于多种商品化的Protein A 介质的性能进行了研究比较，结果表明:以亲水的琼脂糖凝胶作为骨架的蛋白A 介质所得抗体的DNA 残留量比Prosep A 低30%。

d. 更低的蛋白A 脱落：MabSelect 由于通过新型环氧共价交联技术，蛋白A的脱落比其它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低生产成本。微量的脱落可以在后续的层析中，如凝胶过滤或离子交换层析有效去除。

e. 生产过程无动物血清成分：配基重组蛋白A在大肠杆菌中表达，通过多步柱层析纯化，完全适用于抗体药物纯化。

f. 更易于工艺的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。装填在内径为60-80厘米层析柱时，可以在一个工作日处理超过上万升高表达的抗体培养液。

MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，介质寿命是成本效益的一项重要指标，有效的CIP 有助于延长介质使用寿命，但蛋白A 配基比一般层析介质的配基对苛刻的在位清洗 (CIP) 更加敏感，往往不能耐受NaOH，只能使用高浓度的尿素或盐酸胍进行清洗。而MabSelect 的CIP 和除菌程序简单，一般用很常规和经济的试剂如50 mM NaOH + 1M NaCl 或50 mM NaOH + 0.5 M Na2SO4 溶液就可以有效去除沉淀和变性物质; 用非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质；用0.1M醋酸和20%酒精可以SIP除菌。由于CIP所使用的化学试剂不能被重复使用，CIP 试剂的成本对整个生产成本的影响不容忽视。使用尿素、盐酸胍等作为CIP试剂，长期的CIP 成本甚至超过了蛋白A 介质本身的价值 。经测试，Mabselect 配合CIP (50 mM NaOH + 1 M NaCl) 纯化三百次后，抗体产品纯度与回收率不变。

5 MabSelect Xtra ——载量更高的商品化蛋白A亲和层析介质

Mabselect Xtra 介质是目前市场上所有的商品化蛋白A 介质中载量最高的亲和层析介质，其动态载量超过41mg/ml介质(2.4min)。在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积，从而降低生产成本。

Mabselect Xtra介质是在Mabselect 介质的基础上优化而来，它使用孔径更大的多孔高流速琼脂糖 (high flow agarose) 作为骨架，同时减小介质粒径 (75u)。这样不仅增加了比表面积和配基密度，还降低了传质阻力，从而有效的增加动态载量。

R.Hahn等的数据表明Mabselect Xtra的载量高于Prosep vA Ultra等其它蛋白A亲和介质。K. Swinnen 等42 也对近年来较新的蛋白A 亲和介质进行了比较，结果显示：Mabselect 的动态载量几乎不受样品中抗体浓度的影响，因而Mabselect介质的工艺耐用性 (Robustness) 最好；而Mabselect Xtra 的载量最高，Mabselect Xtra对CHO细胞HCP (宿主蛋白) 的吸附比其它蛋白A 介质更是低了近10倍。

除载量更高外，Mabselect Xtra的性质和Mabselect相似，比传统的Sepharose 4FF 介质流速更快，刚性更好；可以使用50mM NaOH+1M NaCl 进行有效的CIP；0.1M 醋酸in 20% 乙醇用于SIP消毒；也具有极低的非特异性吸附，产品纯度高，介质寿命长40。

6 Mabselect Sure ——唯一耐强碱的蛋白A亲和层析介质

在生物药物的生产过程中，为避免细菌、内毒素或病毒的污染，需要对层析系统、介质等进行在位消毒 (SIP)，以保证产品的质量。另外，变性的蛋白、脂类和DNA等分子会不可逆的沉淀在层析柱的顶部而降低柱效和传质速度，从而影响收率和产品质量。

0.1~1N的氢氧化钠可以有效的除菌除热原以及灭活病毒，而且对于沉淀的蛋白、脂类和核酸具有很好的溶解作用，可以有效的对层析介质进行在位清洗 (CIP) 而延长使用寿命，因此使用氢氧化钠进行消毒和清洗成为生物制药生产中SIP/CIP的经典方法。这一点对于内毒素要求极为严格的抗体生产来说尤为重要。

但天然或重组的蛋白A配基对NaOH非常敏感，强碱性条件下易变性或脱落，因此只能选用高浓度的盐酸胍或尿素进行清洗，但清洗的效果远远不如NaOH，而且清洗成本非常高。

天然或重组的蛋白A 配基具有5 个不同的抗体Fc 结合结构域，每个域均可以和IgG的Fc段结合，但不同的域结合强度略有差异。将其中的B domain 中对碱敏感的Asp 氨基酸突变为耐碱的氨基酸，得到新的四聚体配基SuRe Ligand，将此新配基偶联到高流速琼脂糖基质上，成为耐碱的新型高流速Mabselect SuRe 蛋白A 层析介质。

Mabselect SuRe 的优点：

a. Mabselect Sure 可以耐受0.1~0.5N的氢氧化钠：使用高达0.5N的氢氧化钠进行在位清洗/消毒大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，清洗效果更好，有利于延长介质使用寿命，同时也大大降低了CIP/SIP 的成本。

Mabselect SuRe 介质可使用0.1N NaOH 15min/circle 进行“纯化-清洗”循环200次以上仍保持稳定的载量，对碱的耐受性远远好于其它的蛋白A 亲和层析介质。

R.Hahn 的研究也表明：与其他蛋白A 亲和介质相比，Mabselect SuRe 具有无可比拟的稳定性，配基脱落最少，寿命最长，而且宿主蛋白HCP的残留比Prosep A低10倍以上。

b. 更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：新的SuRe 配基是一个同型四聚体配基，避免了不同配基与抗体Fc 段亲和性的差异，也消除了某些域对Fab段的亲和作用，使得洗脱条件更加均一而温和。相比以rProtein A 为配基的介质，Mabselect SuRe介质可以用更高的pH进行洗脱，有效的避免抗体在低pH下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也更低。

c. 不同抗体洗脱所需pH 差异小：由于消除了对抗体Fab 段的亲和作用，使得同一种属亚型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。

d. SuRe 配基稳定性更好：新型的SuRe配基对碱和蛋白酶更稳定47，纯化过程中脱落更少 (<10 ppm)，有利于后期泄漏配基的进一步去除。甚至只有1-3ppm的脱落，无需在后续步骤中增加专门去除Sure配基的步骤，即可达到FDA 的蛋白A 配基残留标准。

Mabslect SuRe 介质是市场上唯一耐碱的蛋白A 亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好，这一点已被文献所证实。纯化所得的抗体除蛋白A 泄漏更少、纯度更高之外，其它产品性质 (如CHOP、电泳、IEF 等) 和Mabselect介质相当。

目前，已有多家大规模抗体生产厂商，将其它蛋白A亲和胶转换为寿命更长、稳定性更好的MabSelect SuRe用于抗体生产。MabSelect SuRe 也成为市场上销量最大的抗体生产亲和凝胶。

本文节选自GE Healthcare 《BioProcess Newsletter》2009年第三期的《抗体生产纯化》。阅读全文请点击此处，前20名填写反馈表的用户还将获得4G优盘一个，先到先得哦。