25分钟完成Western检测?![新品推荐]

【字体: 时间:2009年06月05日 来源:生物通

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  Western检测向来都是一个乏味且耗时的工作,不知不觉,就花去了半天。为了进一步提高western blot的效率,Invitrogen最近又推出了iBlot® Western检测试剂盒,它可是iBlot干转仪的好搭档。它们俩密切配合,能将western检测从3小时缩短到25分钟。它究竟是如何做到的呢?请看本文。

Western blot的原理很简单,不外乎抗原抗体、酶和底物间的相互作用;实验过程也并不复杂,主要就是摸索转膜时间、抗体浓度。然而,western blot听上去还是像个浩大工程,为什么?因为它每个步骤耗费的时间都很长。想当年,一切都是自己动手的时候,配胶、跑胶、转膜、封闭、杂交、检测,这些步骤起码要花一天的时间,还得起早摸晚的。有时候结果不理想,那可真是无比沮丧。后来,有了预制胶,配胶的功夫省了,实验重复性也上了一个小台阶。再后来,Invitrogen推出了iBlot干转仪,转膜只要7分钟,工作效率再次提高。但western的检测仍然是个乏味且耗时的工作,孵育、洗涤、孵育、洗涤……不知不觉,3小时已悄悄溜走。

为了进一步提高western blot的效率,Invitrogen最近又推出了iBlot® Western检测试剂盒,它可是iBlot干转仪的好搭档。它们俩密切配合,能将western检测从3小时缩短到25分钟。这其中的奥秘就是iBlot系统利用电场将带电荷的蛋白(一抗、二抗)迅速转移到膜上,从而加速了抗原-抗体的结合。以往1小时的抗体孵育现在3分钟就能搞定,而且封闭与一抗孵育是同步完成的。这是因为一抗稀释液中含有高浓度的蛋白,其浓度要比一抗高出3-4个数量级,所以非特异性结合可以忽略不计。也有可能是封闭蛋白的分子量比较小,在电场作用下跑得更快。

下图显示了iBlot系统的工作原理。其中浅绿色的就是抗体基质,抗体在电场作用下转移到膜上。

抗体转膜的过程与蛋白转膜相似,只要将这些材料按顺序摞好,赶走气泡就行了。千万不要把顺序搞反了。具体的操作步骤如下:

1. 将绿色的抗体基质放置在透明薄板上。利用一个干净的移液器,将一抗溶液均匀地加在基质上。迷你胶约需3-5 mL;标准胶需7-9 mL。如果你想尝试不同的抗体浓度,也可以将基质剪开,分别加上不同浓度的抗体,并用试剂盒自带的Spacer隔开。

2. 移去iBlot® Western检测阳极堆积层(底部)上的封膜。将装有阳极堆积层的塑料托盘直接放置在转印表面。将托盘与右侧的凝胶挡板对齐。

3. 用镊子将润湿的膜放在阳极堆积层上,并利用转印滚筒赶走气泡。

4. 用镊子将抗体浸润的基质放在膜上。利用转印滚筒赶走气泡。

5. 移去iBlot® Western检测阴极堆积层(顶部)上的封膜。将阴性堆积层放在绿色基质上,电极一面朝上。利用转印滚筒赶走气泡。

6. 选择程序P7,设定转移时间为3分钟。

7. 对于二抗,重复步骤1-6。

8. 在第二次转移过程之后,洗涤膜,接着进行检测。

检测步骤与常规的western相同。试剂盒中提供了抗小鼠或抗兔的二抗,与化学发光和显色检测兼容。除此之外,iBlot Western检测试剂盒还提供了western检测所需的所有溶液——抗体稀释液、洗涤液、检测底物(化学发光或显色)以及iBlot® 检测堆积层。你唯一需要自备的试剂就是一抗。

说了这么多,大家最关心的肯定还是实验结果。又快又好,那才是大家所希望的。下图是iBlot® Western检测试剂盒与WesternBreeze®试剂盒的比较。利用iBlot® 干式转印系统将来自SW480(人结肠腺癌细胞系)裂解物的蛋白转印。小鼠抗-p53抗体作为一抗。检测分别由(A) WesternBreeze® 化学发光试剂盒-抗小鼠或(B) iBlot® Western检测试剂盒(抗小鼠)来进行。实验表明,iBlot® 试剂盒检测蛋白的灵敏度与WesternBreeze® 试剂盒相当。

预制胶+iBlot干式转印仪+iBlot Western检测试剂盒,这真是个完美的组合,western blot能一下子从一天缩短到2个小时,工作效率大大提高。但通常省时省事的产品都不省钱,这个也不例外,适合10次mini胶检测的试剂盒(含PVDF膜)价格在4000多,其实光看堆积层中的铜电极,就知道价格不菲。对于那些不差钱的实验室来说,为了赶进度、发好文章,或许也是值得的。

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(生物通 余亮)

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