新一代测序技术之三国时代(中):Roche/454[选购宝典]

【字体: 时间:2009年06月26日 来源:生物通

编辑推荐:

  2005年454公司首推划时代的新一代测序仪,从而引发了测序市场上454、Illumina、ABI等公司在新一代测序技术上的比拼高潮。也正是这种你追我赶,让绘制人类全基因组图谱由过去的耗费4.37亿美元和13年时间,骤然缩短到如今SOLiD 3运行一次即获得50GB可定位测序数据。生物通6月重磅推出新一代测序技术专题,将逐个为你解析Illumina、ABI、Roche(454)的新一代测序仪,并汇集世界各大基因组中心诸多牛人对新一代测序仪的选择标准及使用反馈。敬请期待!

454公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005年底,454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System,被《Nature》杂志以里程碑事件报道,开创了边合成边测序(sequencing-by-synthesis)的先河。之后,454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。一年后,他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。去年10月,全新的GS FLX Titanium系列试剂和软件的补充,让GS FLX的通量一下子提高了5倍,准确性、读长也进一步提升。

想当年,GS 20的出现,揭开了测序历史上崭新的一页。Jonathan Rothberg博士就是大规模并行测序的发明者,同时也是454的创始人。上世纪90年代,很多学者也都想到了大规模并行测序,他们试图将Sanger测序移到芯片上,但都以失败告终,因为这项技术没有可扩展性。1999年,Rothberg的儿子出世,他放了两个星期的陪产假。小家伙出生后被送入婴儿特护病房,Rothberg非常担心,甚至想获取儿子的基因组信息。这段担惊受怕的经历给了他灵感,他突然意识到焦磷酸测序(pyrosequencing)不仅简单,而且具有可扩展性。两个星期之后,Rothberg就开始设计芯片和流动室,让测序在更小的反应室中进行,并同时进行几百万个反应。

硬件的设计和制造也只是成功的一半,在样品制备上还有同样漫长的路要走。Rothberg摒弃了传统的细菌克隆与挑选,将DNA打断成随机片段,并寻找一种方法来克隆每个片段。受到其他学者乳液实验的启发,他也想将DNA放入油包水的乳液中,这样就省去了反应管。一个好汉三个帮。在Joel Bader等人的帮助下,Rothberg验证了这些想法的可行性,并利用了炸药中的表面活性剂来维持乳液的热稳定性。就这样,乳液PCR终于诞生了。

之后,454生命科学公司用新一代测序仪对DNA双螺旋结构的发明者James Watson进行了基因组测序。第一份个人基因组图谱的绘制只用了两年时间,花费不到100万美元。虽然现在看来这并不算什么,但就当时而言,它相对于人类基因组计划已是质的飞跃。

GS FLX系统的工作流程

GS FLX系统的流程概括起来,就是“一个片段 = 一个磁珠 = 一条读长(One fragment = One bead = One read)”。

1)样品输入并片段化:GS FLX系统支持各种不同来源的样品,包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300-800 bp的片段;对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物,这一步则不需要。短的PCR产物则可以直接跳到步骤3)。

2)文库制备:借助一系列标准的分子生物学技术,将A和B接头(3’和5’端具有特异性)连接到DNA片段上。接头也将用于后续的纯化,扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。

3)一个DNA片段=一个磁珠:单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化,形成油包水的混合物,这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。

4)乳液PCR扩增:每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增,而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言,扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后,乳液混合物被打破,扩增的片段仍然结合在磁珠上。

5)一个磁珠=一条读长:携带DNA的捕获磁珠随后放入PTP板中进行后继的测序。PTP孔的直径(29um)只能容纳一个磁珠(20um)。然后将PTP板放置在GS FLX中,测序开始。放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基,依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板,每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对,就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP硫酸化酶和萤光素酶的作用下,经过一个合成反应和一个化学发光反应,最终将萤光素氧化成氧化萤光素,同时释放出光信号。此反应释放出的光信号实时被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对,就会捕获到一分子的光信号;由此一一对应,就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。这也就是大名鼎鼎的焦磷酸测序。

6)数据分析:GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100多万个读长,读取超过4-6亿个碱基信息。GS FLX 系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析,适用于不同的应用:达400 MB的从头拼接和任何大小基因组的重测序。

GS FLX系统的准确率在99%以上。其主要限制来自同聚物,也就是相同碱基的连续掺入,如AAA或GGG。由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入,同聚物的长度就需要从信号强度中推断出来。这个过程就可能产生误差。因此,454测序平台的主要错误类型是插入-缺失,而不是替换。

点击索取GS FLX系统的更多资料!

新升级让性能全面提升

去年底发布的Titanium系列试剂,是对现有GS FLX平台的重要升级。升级内容包含耗材、试剂和软件。你无需对仪器的硬件做任何昂贵的升级,只改进试剂和软件,就能立刻实现性能提升。升级之后,每轮测序能产生100万个读长片段,高质量(Q20)的读长增加至400 bp。第400个碱基的准确率是99%,之前的更高。通量也提高了5倍,目前每轮运行能获得4-6亿个碱基对,所需时间为10小时。

  • PTP平板的创新重设计  重新设计之后,PTP平板上孔的密度更高,利用更小的DNA捕获磁珠进行金属覆盖,改善了信号质量,因此读长的数量和长度都明显改善,同时准确性更高。目前孔的直径是29 um,DNA捕获磁珠的大小是20 um。
  • 改进的测序试剂  改进的GS FLX Titanium试剂显著降低了背景噪音,因此在几乎相同的运行时间内,读长更加长。
  • 升级的软件  优化用于超高通量测序的软件,能轻松对更大、更复杂的基因组进行拼接和作图。
  • GS FLX 2.0版  它与以前版本的输出数据也完全兼容,让片段能够共同拼接和作图。

广阔的应用天地

在新一代测序技术中,GS系统是最多产的。截至2008年9月,已经发表了250多篇高质量的paper。其中Nature 20篇、Science 13篇、Cell 6篇、Genome Research 20篇、PNAS 24篇。光是这些数据就让人咂舌。这些研究跨越了测序应用的多个方面:82篇全基因组测序论文包括比较基因组学的从头测序和重测序;54篇小分子RNA研究;37篇聚焦快速兴起的宏基因组学;27篇关于转录组图谱分析,包括全转录组拼接和表达图谱;13篇研究染色体结构和表观遗传学;10篇有关稀有变异检测的超深度测序这个新领域;11篇研究古老RNA。其余的文章关注454测序系统的技术和生物信息学。多种多样的应用彰显出454测序系统的能力,那些传统意义上无法用测序来解决的问题现在也一并解决了。

454测序系统除了为多项研究领域开辟了基因组分析之路,同时也加速了探索的步伐。一般来说,研究、分析、撰写并提交论文,经同行评议后发表,需要一年左右的时间。而利用Genome Sequencer系统发表论文的速度,显然表明454测序结果的数据质量高,且分析简单。超长读长与易用的分析工具相结合,让研究人员能更集中精力于科学研究,而不是研究测序过程中的某个技术细节。这样研究项目能快速完成,接着踏上新的研究道路。

与其他新一代测序平台相比,454平台的突出优势是读长。目前GS FLX系统的序列读长已超过400 bp。虽然454平台的测序成本比其他平台要高很多,不过对于那些需要长读长的应用,如从头拼接和宏基因组学,它仍是最理想的选择。

去年底,美国加利福尼亚大学的研究小组利用全新的GS FLX Titanium系列试剂对海洋样品的宏基因组进行测序,发现了一种全新的蓝藻物种,文章发表在11月14日的《Science》杂志上。这项研究是系统升级后发表的首篇文章。首席研究员Jonathan Zehr对于获得数据及分析结果的速度非常震惊。他表示:“多年来我们一直试图培养这种微生物,但都没有成功。有了GS FLX Titanium,我们在几天之内就通过单次测序运行,从环境样品直接获得了宝贵的基因组信息。这个系统超长的读长对于我们从复杂的微生物群体中鉴定并分析这种独特的细菌基因组来说非常关键。”

最近,在454测序平台的协助下,研究人员完成了油棕榈的全基因组测序、拼接和注释。油棕榈是一种重要的经济作物,它的基因组很大,达17 GB。基因组的测序工作是由GS FLX Titanium系统完成的,拼接和分析则是由马来西亚一家生物信息学公司完成的。值得注意的是,这是史上第一次在没有添加传统Sanger测序数据的情况下,完成了对大且非常复杂的植物基因组进行从头拼接。这种快速经济的方法为了解多种经济作物的遗传结构打开了大门。

此外,罗氏旗下的另一家公司NimbleGen正在全球性地捕获定向重测序市场。NimbleGen序列捕获芯片与454的测序仪结合,能让完整的人外显组测序成为现实,最终将为研究流水线输送技术,并促进个性化医疗的开发。NimbleGen序列捕获技术将在后文中详细介绍,敬请留意哦。(生物通 余亮)

相关阅读:

放眼未来,看新一代测序

新一代测序技术之三国时代(上):Illumina

新一代测序技术之三国时代(下):ABI

 

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号