NIH如何利用Acumen平台进行高通量、高内涵筛选？[创新技巧]

美国国立卫生研究院化学基因组中心（NCGC）的常规工作之一是进行自动化的高内涵高通量筛选。那么，你一定想知道，这个经济实力雄厚、研究成果斐然、人才济济、设备先进的顶级研究院选择了怎样的平台？如何进行这种艰苦而乏味的工作呢？那就跟着生物通编者去了解一下吧。

药物筛选本身就像一场赌博。在成千上万的化合物库中，要找到真正能与靶点发生阳性作用的化合物可谓大海捞针。如何才能在这场赌博中成为赢家？工欲善其事，必先利其器。选择一个合适的平台，将起到事半功倍的效果。

美国至TOP的研究院NIH（国立卫生研究院）也是全球首屈一指的顶级研究院之列，人人仰望。旗下美国国立卫生研究院化学基因组中心（NCGC）的使命是应用小分子筛选工具来开发化学探针研究工具，应用在蛋白与细胞功能，以及与生理和疾病相关的生物过程的研究上。NCGC的常规工作之一是进行自动化的高内涵高通量筛选。那么，你一定想知道，这个经济实力雄厚、研究成果斐然、人才济济、设备先进（绝非摆设品！）的顶级研究院选择了怎样的平台？如何进行这种艰苦而乏味的工作呢？

NCGC公布了一系列高内涵高通量筛选的操作步骤，就让生物通编者带你了解一下其中NIH如何在高内涵筛选大的化合物库中应用激光扫描微孔板细胞技术（Laser Scanning Microplate Cytometry）的吧。

什么是激光扫描微孔板细胞技术
高内涵筛选通常离不开微孔板。微孔板读数仪经过不断演化，已经从检测每个孔平均信号的光电倍增管进化到了解单细胞特征的显微镜样成像系统。目前的微孔板读数仪在读板速度和提取的信息量上差异很大。一端是非常快速的读数仪，对于普通的发光或荧光分析，它能在1分钟内捕获板上的数据。此类读数仪在数据收集速度上有着额外的优势，不依赖于孔密度。然而，这些读数仪只测量每孔中细胞群体产生的总体信号。另外，它们的激发光源和检测系统不够灵敏，不能可靠测量GFP这种弱荧光分子。

另一端就是高内涵筛选成像仪，它们能从每个孔的多个细胞中捕获亚细胞水平的高分辨率图像。尽管高内涵筛选读数仪为每个孔提供了丰富的数据，但它们的扫描速度较慢，产生很大的数据文件（高清晰图片，一般为几MB/每孔），数据收集速度取决于孔密度，不利于高内涵高通量的大规模筛选。并且往往受限于显微镜高倍镜的视野而难于全孔成像。

于是，激光扫描微孔板细胞仪应运而生。对微滴定孔中的荧光细胞进行不依赖于显微镜光学的高精度逐点扫描成像，既可以获得亚细胞水平的高内涵信息，又可避免成像的慢速和大量数据，可进行高内涵和高通量筛选。

其代表就是Acumen Explorer（TTP LabTech公司），它提供的读数时间足够满足高通量筛选（HTS），每天能扫描1536孔板中的30万个样品，同时对单个细胞或其它微米粒子进行多参数的测量。它能用于测量荧光蛋白表达、细胞形状的改变，或简单的胞内重分布事件，如细胞质到细胞核的转位。NCGC利用Acumen平台进行超高通量（UTS）的高内涵筛选，至今已有两年多。

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基本原理
Acumen Explorer将激光束聚焦在微孔板的底部，进行高分辨率逐点扫描，并利用光电倍增管收集特定波长范围的表面荧光。单孔中每个点的扫描信号集成即可给出有精确细节的模拟图像，单个物体的荧光特性随后被鉴定。由于数据是以一定密度的数据点而非以图像形式储存，不单节省的存储容量，更加快了速度，同时也突破了高倍显微镜视场的限制，获得全孔扫描图像。X轴的分辨率是以预设的间隔（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或5 um）设定的，而Y轴是用户自行设定的，一般在1到10 um。在1×8 um分辨率下，读取速度为200个全孔/分钟，1536孔板的读取时间大约只需10分钟。Acumen 提供4色荧光分析，可适用于多种用途，488 nm激光适合于激发GFP分析。

保存的成像数据量可根据你的需要而确定：对于鉴定分析表型的关键目标特征，分析开发模式可捕获高密度的信息；然而，对于筛选，HTS模式只收集关键的分析参数，从而将文件大小压缩了几百倍，对于1536孔的1×8 um全孔扫描，数据小于200 KB。这样，后续的文件存储就不再是令人头疼和烧钱的问题了。

Acumen可谓是高通量和高内涵筛选的融合之作，即可作为初筛平台也可以作为次筛平台。一方面以逐点扫描代替显微镜成像，多数情况下可在获得较高分辨率的亚细胞信息（模拟图像与真实图像相当接近），又可以较快的速度和较高的通量进行筛选，避免传统微孔板读板机缺乏细节的缺憾，更多细节信息减少了假阳性假阴性的问题。初筛和次筛之后筛选目标更加明确，可进一步进行高内涵分析。
NIH之选

NCGC的研究人员利用激光扫描细胞技术，开发出几种细胞分析的方法。其中一种是重分布分析，另一种是蛋白片断互补分析（PCA）。下文描述了分析步骤及部分筛选数据。

1536孔板分析优化与筛选的基本步骤

糖皮质激素受体-GFP核转位分析
糖皮质激素受体（GR）重分布分析能够利用GR-GFP融合，观察到糖皮质激素受体从细胞质到细胞核的转位。糖皮质激素受体通常位于细胞质中；然而，诸如地塞米松之类的配体会引起它核转位。由于功能激动剂和拮抗剂都能诱导核转位，因此这个分析只能检测配体，而不管它们在基因表达上的作用。基于这个原因，核转位测量是广泛筛选核受体的配体化合物文库的理想分析。

筛选的分析步骤（1536孔板）

顺序	参数	值	描述
1	试剂	5 ml（600个细胞/孔）	U2OS细胞
2	时间	过夜	37℃、5% CO2
3	筛选化合物	20 nl	40 uM-0.5 nM
4	对照化合物	20 nl	地塞米松
5	时间	2 小时	37℃、5% CO2
6	试剂	3 ul	1.5 uM 溴化乙锭
7	检测器	GFP强度	Acumen

 

研究人员共鉴定出27种活性物质，它们的AC50在12 uM以下。在LOPAC库中注释为糖皮质激素的10种化合物都是活性物质，包括激动剂和拮抗剂。在更高浓度，还发现了其他类的活性化合物，包括注释为磷酸酶抑制剂和G蛋白偶联受体的配体。这些化合物可能靶定了糖皮质激素功能或转位的信号通路成分。

蛋白片断互补分析
蛋白片断互补分析（Protein fragment Complementation Assay，PCA）包含两种非荧光GFP（或GFP变异体）片断，与细胞内的目的蛋白融合。在胞内蛋白非共价结合之后，GFP（或变异体）片断融合，发出荧光。PCA应用于β-抑制蛋白和β2肾上腺素受体（β2AR）的结合上，β2AR上融合了突变YFP的一个片断，而β-抑制蛋白融合了互补片断（图1）。经过激动剂刺激，β2AR被GPCR激酶磷酸化，促使它与β-抑制蛋白的结合增强。在这个分析中，β-抑制蛋白与β2AR的相互作用让YFP片断结合并折叠，产生了可定量的荧光信号。

筛选的刺激步骤（1536孔板形式）：

顺序	参数	值	描述
1	试剂	5 ml（700个细胞/孔）	β2AR细胞
2	时间	过夜	37℃、5% CO2
3	筛选化合物	20 nl	40 uM-0.5 nM
4	对照化合物	20 nl	激动剂（AC100）
5	时间	1.5小时	37℃、5% CO2
6	试剂	1 ul	0.2 mM 萘酚蓝黑
7	检测器	GFP强度	Acumen

筛选的抑制步骤（1536孔板形式）：

顺序	参数	值	描述
1	试剂	5 ml（700个细胞/孔）	β2AR细胞
2	时间	过夜	37℃、5% CO2
3	筛选化合物	20 nl	40 uM-0.5 nM
4	对照化合物	20 nl	激动剂(AC50)、拮抗剂(AC100)
5	时间	1.5小时	37℃、5% CO2
6	试剂	1 ul	0.2 mM 萘酚蓝黑
7	检测器	GFP强度	Acumen

筛选中鉴定出最有效的化合物是β2AR的已知激动剂或拮抗剂。LOPAC库中包含了47种激动剂和35种拮抗剂，它们被注释为肾上腺素受体的配体。在鉴定的19种AC50< 10 uM 的肾上腺素受体激动剂中，18种注释为β肾上腺素激动剂，而另一种为肾上腺素受体激动剂。对于拮抗剂，共鉴定出15种AC50< 10 uM的化合物，其中14种是β2AR拮抗剂，而另一种注释为肾上腺素拮抗剂。在10 uM AC50阈值，20种拮抗剂未鉴定出，而19种注释为肾上腺素亚型特异的。综上，这些结果表明分析准确定义了大部分已知肾上腺素配体的药理学。

从理论上来说，拮抗剂分析能同时鉴定激动剂和拮抗剂。然而，研究人员发现拮抗剂筛选不能像激动剂筛选一样有效地鉴定β2AR激动剂。例如，有效的β2AR激动剂异丙肾上腺素在激动剂形式中AC50为16 nM，但在拮抗剂形式中，刺激信号只让活性略微增加（数据未显示）。因此，为了确保准确地鉴定激动剂和拮抗剂，两种形式的分析都必须进行。

总结
如果想让Acumen Explorer具有最佳分析表现，就需要降低背景荧光、让信号最大化、选择合适的细胞密度和目标特征。研究人员发现分析质量的最大改善是通过降低背景荧光实现的。在GR-GFP分析中，洗涤贴壁细胞能有助于降低背景荧光。而对于β2AR分析中的弱贴壁细胞，洗涤显然不合适，那么可以在孔中加入荧光吸收染料-萘酚蓝黑。

NCGC的研究人员认为，激光扫描微孔板细胞技术是一种强大的技术，能实现类似传统流式细胞仪的细胞分析。尽管它的激发和发射通道不及流式细胞仪多，但该系统在化合物筛选上有着重要的优势。这种技术能直接检测贴壁细胞的荧光信号，这正是无数筛选分析的基础。此外，Acumen可与标准的机器人筛选系统轻松整合，来实现大型化合物库的筛选，每天筛选数量能高达30万个样品。

如果将Acumen与CCD显微镜系统整合，共同应用于筛选过程中，那么它将如虎添翼。Acumen可先以高通量和高内涵的模式鉴定活性孔，接着用CCD显微镜对这些孔进行高分辨率的成像。在GR-GFP的分析中，Acumen根据胞质到核的转位来鉴定活性物质，而成像仪则通过更精细的核定位模式再进行细分。这种整合的检测系统将在高内涵高通量筛选系统的表型分析中大展拳脚。

背景资料
著名的实验仪器厂商TTP LabTech公司将创新的Acumen eX3推向全球市场以来，Acumen已经成为对高涵量药物筛选进行高通量分析的市场领先者，主要安装在多个跨国制药企业研发中心和国家级的科研机构，其中中国办事处自2008年设立以来已经在国内市场售出了5台。Acumen现在发展到的第三代产品已为那些需要进行多重荧光分析和提高细胞荧光分析通量的机构建立了可靠的行业标准，并使这些分析更容易进入初筛领域。

Acumen高内涵高通量平台的应用
TTP LabTech的Acumen eX3为基于细胞的分析筛选提供了非常灵活的方法。这种技术产生了高通量、高涵量及高度多元化的数据，广泛适用于各种生物分析。

Acumen eX3已被应用于药物开发进程的各阶段，并凭借它的灵活性优势被广泛应用于多种生物学应用中的定量分析中，包括毒性检测、病毒传染性、细胞周期、细胞增殖、蛋白激酶活性和报告基因分析。

技术应用范围包括：

脂肪生成	凝集素结合
血管生成	脂肪累积
凋亡	有丝分裂指数
细胞粘附	迁移
细胞周期分析	P-糖蛋白
线虫分型	吞噬作用
细胞分化	磷脂沉积
细胞增殖	蛋白激酶图谱
细胞伸展	蛋白转位
克隆形成	蛋白酶体分析
细胞毒性	报告基因激活
GPCR筛选包括：	RNAi文库图谱
--- Bioimage公司 Redistribution®高涵量路径分析中侦测细胞内蛋白质转位的专利技术 --- Transfluor® GPCR药物开发技术 --- β-内酰胺酶	脂肪变性
	干细胞分型
	组织扫描和成像
杂交瘤筛选	病毒感染性

TTP LabTech Ltd.公司的国内联系方式：
名称：英国腾拓生命科技有限公司上海代表处
地址：上海市张江高科技园区蔡伦路７８０号３楼Ｊ座
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网址：www.ttplabtech.com.cn