廉价的第三代纳米孔测序[创新技巧]

第二代测序正发展地如火如荼，第三代测序也参与进来，欲与其一争高下。第三代测序主要有三种技术平台。两种通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序。另一种则为纳米孔测序。后者的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。

最早的Sanger测序在人类基因组计划中立下赫赫战功，但也给基因组测序贴上了数亿美元的价格标签，让人生畏。这两年发展迅猛的第二代测序仪——Illumina的Genome Analyzer、Roche 454的GS系列以及ABI的SOLiD系统——让人类基因组重测序的费用蹭地降低到10万美元以下。现在，能对单个DNA分子进行测序的第三代测序仪也加入到这场比赛中，让竞争更加激烈。

目前，第三代测序主要有三种技术平台。两种通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序。Helicos的遗传分析系统已上市，而Pacific Biosciences准备在明年推出单分子实时（SMRT）技术。第三种Oxford Nanopore的纳米孔（nanopore）测序还尚未有推出的时间表，但有可能是这三种当中最便宜的。纳米孔测序的优势在于它不需要对DNA进行标记，也就省去了昂贵的荧光试剂和CCD照相机。

最近，Oxford Nanopore Technologies的Hagan Bayley及他的研究小组正致力于改善纳米孔。根据他们之前的工作，他们以a-溶血素来设计纳米孔，并将环式糊精共价结合在孔的内侧（下图）。当核酸外切酶消化单链DNA后，单个碱基落入孔中，它们瞬间与环式糊精相互作用，并阻碍了穿过孔中的电流。每个碱基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的电流振幅，因此很容易转化成DNA序列。每个碱基也有特有的平均停留时间，它的解离速率常数是电压依赖的，+180 mV的电位能确保碱基从孔的另一侧离开。

a-溶血素纳米孔（剖面图）以及共价结合的环式糊精（浅蓝色）瞬间结合落入孔中的碱基（红色）。

以往对甲基胞嘧啶进行测序，都要先进行重亚硫酸盐转化，而纳米孔技术能直接读出这第五种碱基。这对表观基因组测序的研究人员来说可谓是个好消息。

纳米孔测序预计能满足大部分测序用户的需求：99.8%的准确性相当高，且错误很容易通过计算来纠正。均聚物延伸也没有问题，因为纳米孔记录每一个碱基，而不管其前后的碱基。读长也会很长。Bayley认为：“它有可能读取数千个碱基，序列质量也不会下降。即使中途有一些小差错，它也可以重新开始。”

但是，Oxford Nanopore的测序仪仍面临两个重要的技术问题。一是如何将核酸外切酶更好地附着在孔上，让它每次只掉入一个碱基，这是一个大挑战。另一个是并行化。这个问题可能简单一些。他们可以开发出一个芯片，上面有数万个孔，来确保整个测序过程更快速。

在纳米孔测序技术的推动下，实现千元基因组的目标指日可待了。

参考文献：
Clarke, J. et al. Continuous base identification for single-molecule nanopore DNA sequencing. Nat. Nanotechnol. advance online publication 22 February, 2009.