利用多重激光微孔板细胞分析仪进行细胞增殖及细胞周期分析[创新技巧]

作者：Andrew Goulter, Paul Wylie 和Wanyne Bowen
（TTP LabTech Ltd, Melbourn Science Park, Melbourn, Hertfordshire, UK.）

概述：
越来越多的研究人员希望通过高内涵分析从单个样品中获得多种信息，以减少经济和人力消耗的同时增加检测通量。目前这种多重检测的程度受限于可用的试剂----多数荧光探针的最佳激发波长大都在488nm附近，而这些荧光探针在光谱曲线上的重叠限制了它们在多通道分析上的应用。另一个限制是许多荧光检测系统的激发和检测范围仅限于一个狭窄的波长范围，导致它们不兼容某些荧光指示剂。如今，试剂和仪器的同步发展扩充了可用新产品的范围，因而使得以不同的光谱检测多种荧光探针成为可能，提升了多通道检测的能力。

激光扫描荧光微孔板细胞分析仪，Acumen eX3（TTP LabTech Ltd，UK），可在一台仪器中提供405nm，488nm和633nm三种波长的激发光，再加上每种激发光可获取四种荧光检测数据，大大扩展了可组合用于多色多重分析中的荧光试剂的范围，其激发波长范围与白光光源仪器相近。Acumen eX3将CCD成像仪强大的目标识别能力和快速的数据读取速度相结合，能够对96孔，384孔和1536孔板进行全孔高通量化高内涵分析，可达到24小时内获取30万个孔的数据这样的高通量。

荧光微孔板细胞分析仪在癌症研究中应用广泛，包括用碘化丙啶(PI)进行DNA染色（激发波长488nm）研究细胞增殖和细胞周期分析。在此我们通过在Acumen eX3上使用两种DNA染料Hoechst 34580(激发波长405nm)，TO-PRO-3(激发波长633nm)进行分析，并探讨在免疫检测分析中的多通道技术的应用潜力。

结论：
• 不同激发波长（405nm，488nm和633nm）的细胞核染色所得的细胞数目显示良好的相关性
• Hoechst 34580，TO-PRO-3和碘化丙啶（Propidium Iodide）可用于同一单孔中以进行多重分析
• 利用Acumen eX3在405nm，488nm和633nm激发光可活细胞和固定后细胞都能进行细胞周期分析
• 微孔板细胞分析仪非常适用于高通量化高内涵筛选，分析通量可达到每24小时超过30万孔，且无需担心数据储存问题。

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1.Acumen eX3微孔板细胞分析仪

Acumen eX3激光扫描荧光微孔板细胞分析仪是结构紧凑的高通量化高内涵台式仪器，可提供三种波长的激发光。这种设计，尤其当仪器是全集成的时候，有利于在宽范围内以高通量进行高内涵分析。专利的信号阈值方法能提供实时(“on-the-fly”)细胞分析，大大缩小了数据文件的大小——在高通量(HTS)筛选模式下数据文件仅为50Kb左右。

2.常用激发荧光试剂表

Acumen eX3可进行多个波长激光激发，每次扫描获得多达12通道的荧光数据(3个激光×4个PMT检测器)，使之可适用于范围广泛的荧光染料，探针以及蛋白，提升多重检测分析的能力。目前多家试剂和抗体厂商已经与Acumen合作，例如Cell SignalingTM在Acumen上已经测试了700多种荧光标记抗体，以确保这些抗体试剂可以在Acumen中使用。 由于不需要进行细胞核染色来定位细胞。所有探针均可用于报告生物学应答。因为Acumen eX3可提供的染料范围相当于白光光源仪器，所以基于显微CCD成像系统的检测方法可简便地转移到Acumen eX3以进行初筛而且速度更快。

3.利用多通道激光激发进行多重细胞定量

以不同细胞数目接种（每孔156-2500）的HeLa细胞用酒精进行原位固定，并用Hoechst 34580（10uM，405nm），碘化丙啶PI（1.5uM，488nm），TO-PRO-3（0.5uM，633nm）这三种染料染色。用Acumen eX3微孔板细胞分析仪进行分析。在这个实验中，我们研究在多重分析中以多种染料(405nm，488nm和633nm三个激发波长)确定不同细胞数目的能力。这三种DNA染料加入相同的孔，结果表明这三种细胞核染料之间在确定细胞数目上的结果具有密切相关性，其次也证实在同一孔中多重检测全部三种染料的能力。

插图：图A为一个孔中Hoechst染色细胞的图像，图B为图A同一孔的tiff格式输出图片，图C为带有细胞计数的tiff图片。(Image-Pro Plus; Media Cybernetics)

4.细胞周期分析：405nm，488nm和633nm激发波长的DNA染色比较

HeLa细胞（2000个/每孔）以：A.碘化丙啶PI（10uM）；B.Hoechst 34580（10uM）；C.Vybrant® DyeCycle™ Orange（5uM）；D.TO-PRO-3（0.5uM）进行原位标记。在Acumen eX3微孔板细胞分析仪以405nm，488nm和633nm激发波长进行分析。

5.活细胞和固定细胞的细胞周期分析

活细胞用Vybrant® DyeCycle™ Violet染色，在Acumen eX3微孔板细胞分析仪上以405nm激发波长进行分析。固定细胞则用碘化丙啶PI染色，在488nm激发波长进行扫描分析。采用这两种细胞核染料所获得的G1和G2/M期的pEC50值是基本相符的。

6.高通量和数据存储

	96孔板	384孔板	1536孔板
读板时间（全孔扫描形式）- 分钟	9.15	10.24	10.26
读板时间（高通量形式）- 分钟	4.13	4.8	6.67
每24小时读板数	350	300	216
每24小时读孔数	34,000	115,000	330,000
24小时操作所得数据总量	17.5 Mb	60 Mb	170 Mb

Acumen eX3的工作方式是通过400mm²的宽视野镜头扫描一个区域，而不是逐孔扫描。因此任一种符合SBS标准的微孔板扫描所用的时间基本相似，通常以获取全孔数据方式读完整块板的时间只需要10分钟左右，这个时间可以通过减少每孔获取数据区域从而大幅缩减。Acumen eX3每天可以进行数百个细胞培养板分析，且保存数据所占空间很小。以上数据源于Acumen eX3.单激光扫描，扫描精度为1µm x 8µm，读板时间单位为分钟。

背景资料
著名的实验仪器厂商TTP LabTech公司将创新的Acumen eX3推向全球市场以来，Acumen已经成为对高内涵药物筛选进行高通量分析的市场领先者，主要安装在多个跨国制药企业研发中心和国家级的科研机构，其中中国办事处自2008年设立以来已经在国内市场售出了5台。Acumen现在发展到的第三代产品已为那些需要进行多重荧光分析和提高细胞荧光分析通量的机构建立了可靠的行业标准，并使这些分析更容易进入初筛领域。

Acumen高内涵高通量平台的应用
TTP LabTech的Acumen eX3为基于细胞的分析筛选提供了非常灵活的方法。这种技术产生了高通量、高内涵及高度多元化的数据，广泛适用于各种生物分析。

Acumen eX3已被应用于药物开发进程的各阶段，并凭借它的灵活性优势被广泛应用于多种生物学应用中的定量分析中，包括毒性检测、病毒传染性、细胞周期、细胞增殖、蛋白激酶活性和报告基因分析。

技术应用范围包括：

脂肪生成	凝集素结合
血管生成	脂肪累积
凋亡	有丝分裂指数
细胞粘附	迁移
细胞周期分析	P-糖蛋白
线虫分型	吞噬作用
细胞分化	磷脂沉积
细胞增殖	蛋白激酶图谱
细胞伸展	蛋白转位
克隆形成	蛋白酶体分析
细胞毒性	报告基因激活
GPCR筛选包括：	RNAi文库图谱
--- Bioimage公司 Redistribution®高内涵路径分析中侦测细胞内蛋白质转位的专利技术 --- Transfluor® GPCR药物开发技术 --- β-内酰胺酶	脂肪变性
	干细胞分型
	组织扫描和成像
杂交瘤筛选	病毒感染性

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