揭开基因组捕获的神秘面纱[选购宝典]

新一代测序技术催生了丰富多彩的基因组图谱。然而，有些研究并不需要对全基因组进行测序，而只需对特定的基因组区域进行研究，比如外显子、SNP区域或与疾病相关的区域。如何高效地捕获这些区域？生物通现在就揭开基因组捕获的神秘面纱，带你走近目前主流的两种技术。

新一代测序技术之所以迷人，是因为它一次运行几天就完成了我们若干人若干年才能完成的任务。在新一代测序的推动下，各种生物的基因组图谱纷纷出炉，一时呈现出百花齐放的繁荣景象。然而，有些研究并不需要对全基因组进行测序，而只需对特定的基因组区域进行研究，比如外显子、SNP区域或与疾病相关的区域。如何高效地捕获这些区域？在07年之前就只能依赖传统的PCR，不过大量的引物设计、合成、实验及优化，个中艰辛可能只有做过的人才清楚。

不过，科技的魅力就在于其不断创新，生命科学尤其如此。在2007年11月，《Nature Methods》上出现了三篇文章，都是描述大基因组区域的富集和捕获方法。其中两种是采用基于芯片的杂交捕获方法^1,2，而另一个则利用分子倒置探针来分离特异的基因组区域³。

罗氏公司旗下NimbleGen公司立刻注意到了芯片的方法，并开始了最初的验证工作。他们设计了一块芯片，预计能捕获6726个基因组区域和一系列大小在200 KB到5 MB的染色体区域，将片段化和扩增的基因组DNA与之杂交。结果显示65-75%的捕获序列能与目标序列对上。于是，Roche NimbleGen开始了序列捕获芯片的商业化之路。

经过它的不断完善和扩展，Roche NimbleGen现在已经拥有多种标准和定制的捕获芯片，包括最新推出的人外显组捕获芯片，它是基于高密度的芯片平台，内含210万个寡核苷酸探针，能捕获18万个人编码外显子和近700个microRNA外显子。这些全新的解决方案一步就完成富集步骤，极大地节省了费用、人力和时间。此外，这种芯片可以量身定制，能捕获连续或分散的基因组区域，灵活性非常高。

NimbleGen序列捕获芯片的原理与一般的芯片类似，不过据罗氏的专家介绍，探针的长度会稍长一些。至于探针的具体信息，那就是NimbleGen的专利了，外人不得而知。捕获过程也很简单：基因组DNA被打断，然后与定制的序列捕获芯片杂交，没有杂交上的片断被洗掉。富集的目标群体随后被洗脱并扩增，再用GS FLX进行高通量测序。

NimbleGen序列捕获芯片的优势：

• 定向捕获基因组目标区  目前一块芯片最长可捕获5 MB的指定基因组区域，特异性和覆盖度都很高。
  
• 数据可靠  芯片上包含了对照探针，用于验证系统的性能。基于已知、独特的基因座，这些目标区域提供了对照基因座富集水平的定量测定方法。
  
• 你说，我捕获  每个人感兴趣的区域都不一样，只要你选择出想要捕获的区域，Roche NimbleGen就会设计并合成一块定制的序列捕获芯片。捕获区域可以是连续或非连续的基因组长片段、全外显组或其他任何区域。
  
• 省钱、省时又省事  有了这块芯片，什么引物设计、PCR，都抛到脑后吧，一次就得到了可直接用于测序的所有目标区域。与PCR方法相比真是省钱、省时又省事。
  

今年初，NimbleGen又突破性地推出了人外显组捕获产品。它利用了优化的设计算法（2008年10月推出的385K平台），提供了迄今为止表现最佳，功能最强大的NimbleGen序列捕获芯片设计。这种优化设计的目标是以相等的效率捕获所有目标区域，并全面减少所需的测序，从而降低测序费用。人外显组产品是建立在新的高密度HD2（210万个长寡核苷酸探针）平台上的NimbleGen序列捕获芯片。此产品能在单个芯片上捕获人基因组的几乎所有编码区域（约18万个人编码外显子和约700个miRNA外显子）。

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一直以来，人外显组测序被许多研究人员认为是重测序中的“圣杯”，它将带来重大的生物医学突破。外显组测序本身能探索许多功能变化，而这些变化引起了多种常见及稀有的疾病（如癌症和老年痴呆症）。在NimbleGen人外显组序列捕获芯片推出之前，外显组的测序无论从技术上还是经济上都是不可行的，因为制备所有人外显子的传统PCR方法不但昂贵，而且耗时。Roche NimbleGen的序列捕获技术和454测序系统让完整的人外显组测序成为现实，最终将为研究流水线输送技术并促进个性化医疗的开发。

无独有偶，安捷伦科技公司也瞄准了这个市场，推出了SureSelect Target Enrichment System。这个试剂盒是源自Broad研究院的授权。去年Broad研究院的研究人员曾利用生物素化的RNA作为诱饵去捕获溶液中的DNA靶点。后来，安捷伦获得了此项技术的授权，并加上了质量控制步骤，将它包装成一个试剂盒。安捷伦的产品与Broad研究院原始方法的最大区别在于诱饵的长度，现在的120聚体取代了原始的170聚体。

目标富集，也称为定向重测序、基因组划分或DNA捕获，在研究人员只对基因组的某个特定区域感兴趣时相当有用。SureSelect平台能在测序前捕获一系列外显子或其他基因组目标，并洗掉基因组的其他部分。SureSelect取代了其他耗时耗力的定向重测序方法，突破了大部分新一代测序流程中的主要瓶颈。

安捷伦的基因组划分产品有别于NimbleGen的序列捕获芯片，是一种In-Solution的解决方案，包含了客户指定的探针混合物，单管中最多包含55000个生物素化的RNA探针。这些捕获探针长度为120 bp，是目前市场上最长的。它们能有效捕获包含未知突变的DNA，如SNP、插入或缺失。SureSelect试剂盒有多种包装，适于几十个到几千个样品，也能与超高通量流程中的自动化相适应。SureSelect目标富集系统的流程如下：

1. 基因组DNA被打断，并组装成测序平台特异的文库形式。在捕获之前对文库大小进行选择，并利用电泳等方法来验证。
2. 精选大小的文库随后与SureSelect诱饵共同孵育24小时。
3. 加入链酶亲和素标记的磁珠，并通过强磁铁从混合物中钓出RNA诱饵-DNA杂合体。
4. 洗脱磁珠，将RNA诱饵降解，剩下的就是目的DNA。接下来就是常规的扩增和测序了。

用户可利用安捷伦的eArray在线设计工具，自行设计SureSelect探针混合物。eArray工具中包含了许多主要的基因组，用户也能上传他们自己的序列。这个直观的在线设计工具是安捷伦定制基因组产品的核心，在芯片研究群体中颇受欢迎，现在又扩展到新的SureSelect平台。eArray让研究人员轻松设计他们所需的工具，不收取任何费用。

Agilent SureSelect目标富集系统最初是为Illumina的Genome Analyzer系统而设计的。两天前，安捷伦又和ABI公司联合推出适用于SOLiD系统的富集系统。

到目前为止，一些早期用户已经试用了安捷伦的SureSelect系统，包括Wellcome Trust Sanger研究院。其测序技术开发的主管Daniel Turner表示：“安捷伦SureSelect目标富集系统的性能给我们留下了很深的印象。该技术与对手相比，有几个重要的特点：它操作简单，很容易扩展到96孔的形式；它比芯片或PCR等方法需要更少的基因组DNA；特异性极佳。实际上，它所需的DNA起始量只有其他平台的十分之一，因此对于珍贵样品而言是再适合不过了。”

今年7月，安捷伦还与冷泉港实验室合作，推出了以芯片为基础的基因组划分产品。原理与上一代产品相似，SureSelect DNA捕获芯片也能从完整基因组中提取用户定义的基因组区域，从而大幅度降低测序费用。两者的区别是：溶液型的SureSelect目标富集系统适用于样品数量上千的大规模高通量测序研究，包括自动化的高通量流程，而捕获芯片则是它的补充，适合小型化的研究。

在一项合作研究中，安捷伦利用244K SureSelect DNA捕获芯片来捕获乳腺癌相关的外显子区域。利用60聚体的探针大致捕获到0.025%的人类基因组，包括1287个分离的基因组区域，然后释放并测序。最终，在目标区域获得了2700倍的富集。结果验证了SureSelect DNA捕获芯片的有效性。测序读数覆盖了目标区域的99.8%以上，而98%的目标碱基都至少有一次读取。这些结果证实DNA捕获芯片是定向测序的快速有效方案，尤其适合小型研究。

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总的来说，基因组捕获还是一个相当年轻的技术，从出现至今不过两三年的时间。这些新技术都将面临的一个问题是，如果某一天，人类基因组的测序费用真的降到了1000美元或以下，基因组捕获该往哪里走。随着测序的通量越来越高，费用越来越低，当有一天测序整个基因组的费用与捕获+测序相同时，捕获还有必要存在吗？有人认为它不会永远存在，也许是一年，也许是五年，没人知道。但无论如何，它让现在的研究人员受益无穷，这是无可非议的。

至于如何选择合适的基因组捕获技术呢，请看生物通后续报道之《基因组捕获之有问有答》。

（生物通 余亮）

参考文献：

1. Albert, T.J. et al. Direct selection of human genomic loci by microarray hybridization. Nat. Methods 4, 903–905 (2007).
2. Okou, D.T. et al. Microarray-based genomic selection for high-throughput resequencing. Nat. Methods 4, 907–909 (2007).
3. Porreca, G.J. et al. Multiplex amplification of large sets of human exons. Nat. Methods 4, 931–936 (2007).