基因组捕获之有问有答[心得点评]

随着新一代测序技术的发展，基因组定向捕获中的学问也就越来越大。PCR当然也并非不可，过去人们都是用PCR来选择性扩增目的片段，但关键是效率不高，引物的设计也相当费神，花费还不小。近两年来，市场上也出现了一些定向捕获基因组的技术。如何选择这些技术？它们有着怎样的优缺点？我们还是来听听专家的意见吧，他们毕竟切身体会过。如果专家们也不能解决你的问题，那希望文末的相关资料能助你一臂之力。

Q1：你选择哪一种捕获方法？为什么？

华盛顿大学基因组测序中心Jon Armstrong：
我们选择的是液相捕获。溶液中的DNA-DNA杂交动力学比固相中更易理解，且液相中的杂交更高效。我们只用1 ug左右的DNA即可，比目前任一种固相技术更节约样品。而且，液相比固相更容易进行多重和自动化分析。

贝勒医学院Matthew Bainbridge：
我们用的是罗氏NimbleGen序列捕获芯片。目前的HD2芯片能在单个芯片上捕获整个CCDS外显组（36 MB）。它们提供了目标之间的泊松分布覆盖以及跨越目标长度的均匀覆盖。

范德比特大学医学中心Shawn Levy：
我们了解过所有的捕获技术，也期望在基因组测序的定向DNA富集领域能有持续的发展和进步。到目前为止，我们非常满意芯片的捕获。定制的NimbleGen芯片不但高效，使用也很简单，能捕获人和小鼠上中等（250 kb）到大量（6 MB）的基因组DNA。我们能够使用现有的芯片杂交设备来处理这些芯片，从而降低了资金消耗。样品制备方法的简单性还能对每个芯片设计进行优化，并为上样时严格的DNA条件提供灵活性。

埃默里大学医学院Michael Zwick：
我们只用过固态的方法。基于以下三个理由，我们始终关注这种方法。第一，进行少数实验的花费比溶液方法要低得多。第二，我们已?shy;开发了必需的硬件，能在实验室中开展实验。第三，我们有兴趣捕获所有类型的遗传变异（SNP和插入缺失），而现在还不知道液相方法是否能有效捕获插入缺失。我们的终极目标是选择最佳的技术，能够解决我们所关注的人类遗传学问题。

Q2：你如何增加捕获的特异性？

华盛顿大学基因组测序中心Jon Armstrong：
捕获中特异性降低可能是由于：1) 捕获探针的设计不佳；2) 并非最佳的捕获条件；3) 基因组DNA中重复序列的封闭不充分；4) 基因组DNA与捕获探针的比例不是最优。我们目前正在改进所有条件的参数，以增加特异性。

贝勒医学院Matthew Bainbridge：
我们做了大量的工作来优化捕获和洗脱的条件，以及封闭DNA的使用量。我们还在进行新探针的设计，它能够富集捕获出的DNA。

范德比特大学医学中心Shawn Levy：
我们优化了操作步骤中的几个点来改善特异性和整体分析的效率。最终的大小、大小分布和DNA的使用量都一一检查过。此外，杂交、洗涤和洗脱的方法也?shy;过优化，以提高产量和特异性。通过这些努力，我们大约使整体产量增加了40%。尽管产量有了明显提高，但芯片的特异性似乎变化不大。具体的百分比随芯片设计的不同而不同，但对于同一种芯片设计，这个百分比一般都是非常接近的。

埃默里大学医学院Michael Zwick：
优化样品的杂交和洗脱有多种方法。其中包括温度、oligo设计和洗脱液捕获等参数。

相关资料：
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