Methods：胚胎干细胞培养（一）

　　

生物通报道：胚胎干细胞 (ESC)是一种永生化细胞 ,在适宜培养条件下具有永久的自我更新能力并维持未分化状态、高端粒酶活性、正常核型、胚胎表面标志及多潜能转录因子的表达 ,如SSEA、OCT- 4、Nanog等。ES被认为可以提供一种理想的生物学平台 ,用于多方面的科学研究与临床应用 ,如药物筛选平台的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、基因靶向敲除动物模型的构建、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等。

现有胚胎干细胞的培养和诱导分化，一般离不开动物源培养基，比如从实验鼠身上分离出来的结缔组织细胞和牛胚胎血清等。但是这些成分的加入也造成了一定的影响，如何选择最优化的细胞培养基对于ESC的研究及临床应用是至关重要的。生物通特总结了相关培养方法及一些产品，希望能帮助有这方面需要的研究人员找到更适合自己实验的培养方法。

一个合格的ESC培养基的首要条件为促进ESC的永久性分裂增殖及维持ESC的未分化状态，前者是对ESC数量上的要求，后者是对功能的保证。为满足这两个条件，科学家们建立了有很多的标准方法，一般要求ESC生长在有丝分裂失活的饲养层细胞上，基本培养基多为DMEM并添加胎牛血清(FCS)及白血病抑制因子 (LIF)等。另外为了排除不明外源血清成分及病原体等干扰，在满足促进 ESC分裂增殖及维持其全能性的基础之上，又尝试及建立了其他培养基，包括条件培养基 (CM)、无饲养层、无血清、血清替代物 (SR)非条件培养基等。

1.饲养层(feeder layer) 培养体系

饲养层培养体系是ESC体外培养建系中最常用的一种技术方法。研究发现饲养层对ESC自我更新及全能性的维持起重要作用，虽然机制还不是很清楚，但是科学家们认为很大程度上与饲养层所提供的细胞接触及复杂的蛋白分子环境有关。

目前常用的饲养层有STO、小鼠胚胎成纤维细胞 (primarymouse embryonic fibroblast,MEF)、SNL (G418R基因和 LIF基因转染的 STO)、HBC25637等。其中赫赫有名的就是MEF，这种培养体系以其易于取材、抑分化效果好，分离方法便宜等特点而被广泛应用。

制备饲养层可以通过在胚胎成纤维细胞中加入小牛血清和DMEM培养基，之后经过酶处理，培养箱培养获得。但是由于这些具有活性的外源性细胞一方面血清和MEF的使用会带入很多的变数，MEF饲养层用于hES的维持并不方便，而且昂贵、费时，另外作为异种抗原会影响hESC的正常生长与增殖，若发生细胞间融合则会引起ESC表达异源性抗原，这将给hESC的临床移植治疗带来免疫排斥反应，也会增加对ESC的污染，可能给患者带来巨大危险。因此研究人员也在摸索相关的培养条件。

比如来自英国的研究人员提出利用人源性体细胞作饲养层建立一株无动物源性蛋白污染的细胞系，可能将为今后临床治疗性的应用提供安全的来源。或者利用人的骨髓间充质干细胞 (mes2 enchymal stem cells ,MSC)作为饲养层细胞支持 hES细胞的生长，实验证明经过13代的传代，细胞仍保持hES细胞未分化状态的分子生物学的特征。

MEF培养体系可以自制，也可以通过一些厂家购买，不过来自在hES细胞研究领域处于领先水平的WiCell™ 研究所的Daisy Manning提出，虽然能买到小鼠胚胎成纤维细胞，但是建议自己培养为好，她说“从怀孕的母鼠体内能够获得12到15瓶，成本只有26美元。如果从商业市场购买的话，4瓶鼠胚胎纤维原细胞就要花掉50美元，也就是说用两倍的价格只能得到六分之一的细胞。此外，买回来的根本就不知道是什么样的鼠胚胎纤维原细胞。通常最多只能用到第五代细胞，因为之后这些细胞会大量死亡，有些供应商出售第三代或第四代的鼠胚胎纤维原细胞，这样一来它们对于胚胎肝细胞培养来说根本毫无用处。”

Tips（来自The Scientist）：

来自WiCell™ 研究所的Daisy Manning的建议——
1．抓紧时间、耐心等待

Manning提出：“我们让学员们了解到人体胚胎干细胞研究不是个短期工作，即使实验室中一切都已经就绪，那最少还要花费十六周时间才能完成从衍生鼠胚胎纤维原细胞到完全培养出大量人体胚胎干细胞然后进行冷冻。所以，整个细胞实验过程在有完备实验室的条件下也要花费四到六个月。”

2. 千万不要购买商业性的鼠胚胎纤维原细胞

虽然能买到鼠胚胎纤维原细胞，但是WiCell研究所建议还是自己培养为妙。“从怀孕的母鼠体内能够获得12到15瓶，成本只有26美元。如果从商业市场购买的话，4瓶鼠胚胎纤维原细胞就要花掉50美元，也就是说用两倍的价格只能得到六分之一的细胞。此外，买回来的根本就不知道是什么样的鼠胚胎纤维原细胞。通常最多只能用到第五代细胞，因为之后这些细胞会大量死亡，有些供应商出售第三代或第四代的鼠胚胎纤维原细胞，这样一来它们对于胚胎肝细胞培养来说根本毫无用处。”

3. 检查辐射源

研究过程中，必须使用辐照来暂停生长。Manning 表示，WiCell研究所的规定要求辐照剂量应该为8000拉德（辐射剂量单位），但这是一个变量。“因为我们在实验发现，随着辐照源的不同，辐照量也会变化，”她补充说。“对于铯辐照器来说，8000拉德正好，但是对于X射线来说，辐照量需要在12000拉德以上。”虽然这一过程可以使用丝裂霉素C来代替，但是Manning建议还是尽量使用辐照的方法。“胚胎干细胞对化学药品十分敏感，”她解释说。“当你用化学药剂来钝化鼠胚胎纤维原细胞时，一定要保证在加入胚胎干细胞前清除了所有的化学药剂。”

4. 快速解冻！

Manning提出：“尽可能快地解冻细胞。这是因为我发现有几次我和另一位学员解冻的细胞在几乎同等条件下，她最后所得到的细胞团只有我的50%左右。虽然我们使用的时间只有30到45秒左右的差距，但是最后我们所取得的结果差别很大。”她建议，尽可能在实际解冻胚胎干细胞前按照要求操作几次，这样有助于减少浪费时间。

5. 两周的等待

别想着在解冻后很快就会培养出大量的细胞，在这一过程中只有0.1% 到 1%的细胞能够存活下来。Manning说：“我们一直告诉学员们每天都要注意它们的发展，因为细胞团随时可能会出现，也许三、五天，甚至七、八天，突然之间你就会发现细胞团出现了。”解冻十四天后还没有出现细胞团并不意味着实验失败，而且不要忽视外表组织的边缘，她补充说。“因为很多时候这些部位会出现大量的细胞团。”（用手指放在外表组织的边缘挡住光线衍射就能看到。）

6. 每天对细胞的培养

要每天观察人体胚胎肝细胞的生长过程并添加养分。“而且永远别让它们过量生长，一般来说这些细胞每周会分裂一次。”人体胚胎干细胞的机构紧密、均匀而且边缘清晰，而分化出的细胞团参差不齐、边缘凌乱或者有透明的中心点。在低倍数的放大镜下，健康的细胞团发白，而那些在溶液中发黄的细胞团类似发育中的胚胎很有可能会分化。

7．越多关注、越多收获

经验丰富的人体胚胎干细胞研究者一般都十分关注细胞的生长过程。“如果一个研究者关注细胞的生长，就会花费很多时间用显微镜观察它们，而且会熟悉分化前这些细胞的外表特征。久而久之，他就能学会预测下一步细胞会产生什么样的变化。” Manning补充说，因为人体胚胎肝细胞比其他科学研究更讲究，所以很多东西在课堂上是无法传授的，但是培训课程能够帮助学员学会如何做出正确的判断。

8． 分化开始

ESC分化虽然会给细胞的培养带来一些困难，但这也是件好事，它表明培养基很健康。如果培养基没有出现任何问题，那么很有能已发生了什么问题。“当胚胎肝细胞突然生长的很快，很健康，而且从未分化过，那么你就该想想是否有什么地方出了问题，” Manning解释说。

9．决定研究步骤

Manning提出：“对于如何处理人体胚胎肝细胞培养板，我们有一条不成文的规定：那就是对于分化率为10%的培养板，我们不做任何处理；如果分化率在10%到50%之间，我们会用一种叫做‘挑选移除’的方法去掉分化了的细胞；如果分化率大于50%，用‘挑选保留’的方法借助机械将未分化的细胞团转移到一个新的鼠胚胎纤维原细胞培养板上。”

 Methods：胚胎干细胞培养（二）
 Methods：胚胎干细胞培养（三）

（生物通：张迪）