HTRF IP-One细胞水平检测[新品推荐]

Cisbio基于HTRF技术的IP1测量试剂盒就是IP3含量的变化研发出来的，是研究Gq通路的良好工具。目前该试剂盒被广泛应用于药物的高通量筛选。HTRF IP1测量试剂盒是基于HTRF技术的竞争性免疫检测，使用了铽穴状化合物（Tb cryptate）标记的抗IP1单抗和d2标记的IP1。

Gq信号传导通路简介
G蛋白介导的信号传导通路主要有三种，通过G蛋白的四个亚型来介导：Gs、Gi、Gq和G12/13。Gs和Gi通路的效应分子为cAMP，引起蛋白激酶A（PKA）的活化或抑制。G12/13通路的效应分子为Rho鸟嘌呤交换因子（RhoGEFs），能通过别构效应激活胞浆小GTP酶Rho。Gq通路的效应分子为磷脂酶C-β（PLCβ），引起细胞内Ca2+浓度升高（见图1）和钙调蛋白的活化。具体如下：细胞外的信号分子与Gq受体结合后，激活细胞膜上的磷脂酶C，水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）为肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3与滑面内质网和线粒体上的受体结合，钙通道活化，引起细胞内钙离子浓度升高。DAG的作用是激活蛋白激酶C（PKC），引起许多蛋白的磷酸化。钙离子可与DAG一起活化PKC，并可激活钙-钙调蛋白激酶通路，引起炎症、代谢、凋亡、平滑肌收缩、记忆、神经元生长等特定反应。IP3和DAG介导的信号通路通过Ca2+-CaM联系在一起，钙流变化在Gq介导的信号通路中起着至关重要的作用。

Gq通路活性的检测有两种途径，分别测定细胞内Ca2+浓度的变化和IP3含量的变化，前者主要通过荧光法来实现。后者中的IP3半衰期很短，不到30秒，其产生后在5’磷酸酶的作用下很快生成IP2，然后生成IP1，终产物为myo-肌醇。LiCl能够阻断由IP1到myo-肌醇的产生过程，所以如果细胞内加入一定浓度的LiCl，可引起IP1的积聚。通过测定IP1的含量，可以知道细胞内IP3的产量，从而研究Gq通路的活化过程（见图2）。Cisbio基于HTRF技术的IP1测量试剂盒就是基于这一原理研发出来的，是研究Gq通路的良好工具。目前该试剂盒被广泛应用于药物的高通量筛选。

实验原理：
HTRF IP1测量试剂盒是基于HTRF技术的竞争性免疫检测，使用了铽穴状化合物（Tb cryptate）标记的抗IP1单抗和d2标记的IP1。细胞所产生的IP1和试剂盒所提供的标记了d2的IP1竞争抗IP1抗体的抗原结合位点。当铽标记抗IP1抗体与d2标记的IP1结合后，会发生能量共振转移，产生比较大的信号。随着细胞内产生的IP1增多，游离的IP1与抗体结合增多，信号逐渐减小（见图3）。

HTRF技术称为均相时间分辨荧光技术（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence）, 其结合了荧光共振能量转移（FRET） 和时间分辨荧光技术（TRF），是一种很灵敏且稳定的技术。在FRET实验中，当供体和受体相离很近时，在供体和受体之间会有荧光共振能量转移而产生信号。而TRF采用了半衰期非常长的镧系元素（铕和铽），可以在普通荧光衰变完毕之后进行检测，消除了普通荧光的干扰，能得到更真实的实验数据。并且，HTRF技术采用了双波长检测，能够显著减少缓冲液和培养基的干扰，最终的信号跟产物形成的量成比例。

产品特点：

• 基于细胞的功能性实验
  
• 不需洗涤的简单方便的实验方案
  
• 稳定的实验结果（EC50从1小时到7天均保持稳定）
  
• 理想的筛选窗口，Z’大于0.85
  
• 可以微型化到10 μL体系

产品应用：

• Gq相关的受体活化
  
• 缓慢结合和快速结合的激动剂均可检测（钙流只能测定快速激动剂）
  
• 评估激动剂，拮抗剂，别构效应物以及逆向激动剂

实验流程
整个实验过程非常简单，只需要将细胞准备好、加入化合物、加入HTRF试剂、检测即可，见图4。细胞可以用新鲜培养的细胞，也可以用冷冻细胞。

产品性能

实验结果：
HTRF IP1测量试剂盒是验证过的适用于评估Gq受体活化的检测方案。针对一系列Gq受体和相关的配体，把HTRF IP1测量试剂盒与磷酸肌醇同位素测定方法和钙流检测方法进行了比较，EC50具有可比性。图5显示的是内源性的V1A与受体结合的浓度抑制曲线，IC50分别为0.85 nM、0.43 nM和0.62 nM。表1 列出了部分IP1验证过的受体及其与同位素方法的比较，从中我们可以看出HTRF IP1检测方法可以取代同位素法。

表1：部分 Gq受体激动剂用HTRF方法和同位素方法测定的EC50比较表

*：采用悬浮细胞, 其余均为贴壁细胞

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