Qiagen为您奉上完整的甲基化研究方案[选购宝典]

QIAGEN公司早在2006年就推出了第一款甲基化相关产品。一晃四年过去了，QIAGEN的甲基化研究产品线也在不断丰富。DNA甲基化研究的整个流程包括：样本的采集和稳定，基因组DNA 纯化，亚硫酸氢盐转化及CpG位点的甲基化检测。在此流程中的每一步，QIAGEN都有稳定可靠的产品奉上，且听生物通小编一一为你介绍。

众所周知，DNA突变会导致表型改变。然而，序列不变化，基因调控照样能发生，这就是表观遗传学的威力。DNA甲基化是表观遗传学中的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育中起着重要作用，也与多种癌症密切相关。

脊椎动物的DNA甲基化通常发生在CpG岛中的胞嘧啶。CpG岛是CpG二核苷富集区域，GC含量大于50%，长约200-500 bp。甲基化是由DNA甲基转移酶所催化的，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（5mC）。这样一个简单的生化反应却有着意想不到的严重后果。许多重要的过程如胚胎发育和细胞周期调控都与甲基化息息相关，而多个癌症也表现出异常的甲基化模式。甲基化的存在就像一个开关，在不需要基因表达的时候将基因的活性关闭；去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。

由于普遍认为DNA甲基化在多种疾病尤其是癌症中扮演着重要的角色，所以人们对表观遗传学研究寄予厚望，希望能从中发现新的诊断和治疗的生物标志物。据专家预测，目前表观遗传学应用的整个市场以每年60%的速率增长，到2012年将超过40亿美元。QIAGEN公司最早看到了这个市场的潜力，于2006年就推出了第一款相关的样品制备产品。一晃四年过去了，QIAGEN的甲基化研究产品线也在不断丰富。

DNA甲基化研究的整个流程包括：样本的采集和稳定，基因组DNA 纯化，亚硫酸氢盐转化及CpG位点的甲基化检测。在此流程中的每一步，QIAGEN都有稳定可靠的产品奉上，且听生物通小编一一为你介绍。

基因组DNA提取

这个就不用多说了吧。QIAGEN作为核酸纯化方面的领头羊，提供了样本采集、稳定以及gDNA 纯化的多种试剂，如PAXgene Blood DNA Kit、QIAamp Kit、DNeasy Kit 等。且不要小看上游的基因组DNA提取，基因组DNA的纯度和产量都会对亚硫酸氢盐转化效率以及后续的甲基化特异性PCR（MSP）等分析结果产生重要影响。

亚硫酸氢盐转化

甲基化分析的道路有许多条，但亚硫酸氢盐转化却是必经之路，大约九成的研究人员都会用到。基因组DNA 经过亚硫酸氢盐处理，序列中未甲基化的胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶保持不变。亚硫酸氢盐转化一直被人诟病的地方是操作繁琐，且效率低。这是因为转化步骤需要在高盐，高温以及低pH等极端条件下进行，这些苛刻的条件会导致DNA高度片段化。

QIAGEN的EpiTect Bisulfite Kit 采用简单的流程，可在6小时将DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全转化成尿嘧啶，且手工操作极少，而传统方法需要18个小时。整个过程只需上样、洗涤、洗脱这几个简单的步骤。DNA经过热变性和亚硫酸氢盐转化后，被上样到EpiTect分离柱或96孔板上，使用优化的缓冲液和标准化的离心步骤或真空装置，洗去所有的亚硫酸氢钠并洗脱DNA。洗脱的DNA可用于各种下游应用，如甲基特异性PCR，定量PCR分析，亚硫酸氢盐测序，结合亚硫酸氢盐的限制性内切酶法分析（COBRA）以及焦磷酸测序（Pyrosequencing）。

以往，研究人员总是为转化效率太低而苦恼，而EpiTect Bisulfite Kit 采用全新的保护机制防止DNA降解，即使是1 ng的DNA也能获得灵敏的结果，转化率高达99%。而且试剂盒对不同的起始样品量一视同仁，无论是低至1 ng的DNA，还是高至2 µg的DNA，试剂盒都以相同的效率转化。对于微量样本，转化后的DNA还可用EpiTect Whole Bisulfitome Kit进行全基因组扩增。该试剂盒采用等温多重代替扩增（MDA）技术，可从50 ng 亚硫酸氢盐转化后的DNA 扩增得到1-3 μg DNA，足够下游100-300 次MSP实验使用。

至于转化之后的DNA回收，那向来是QIAGEN的拿手好戏。QIAGEN使用经典的硅胶膜技术，确保 85%以上的回收率，同时还可以高特异性地去除亚硫酸氢盐等对后续PCR有抑制作用的组分。

此外，试剂盒中的DNA保护缓冲液也非同一般。它采用独特的配方，防止DNA过度片段化，保证后续大PCR片段的扩增和分析，并实现有效的DNA变性，从而产生了转化所需的单链DNA。这一有效的完整DNA回收确保转化后的DNA可保存长达18个月，而如果使用自制试剂转化DNA，则只能保存短短的2-4周。DNA保护缓冲液还包含有pH指示剂染料，从而保证胞嘧啶转化时正确的pH条件。

CpG 位点甲基化状态检测

亚硫酸氢盐转化完成后，根据研究目的的不同可以选择不同的DNA 甲基化检测方法。首先应该明确是研究整体水平的甲基化还是特定位点的甲基化，或是要发现全基因组中新的甲基化位点；其次，根据客观条件筛选方法，如：目标序列是否已知，是定量研究还是定性研究，样本来源及数量如何，是否需要高通量的样本检测方法；最后，选择灵敏、可靠、经济、简便的方法进行分析。

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QIAGEN为甲基化检测提供了多种方法（上图）。EpiTect HRM PCR Kit 应用高分辨率熔解（HRM）技术，高通量筛查亚硫酸氢盐转化后CpG甲基化位点的状态变化。EpiTect MSP Kit则提供了特定CpG位点甲基化的定性分析。该试剂盒采用了能分辨引物 3’ 端单个碱基错配的HotStarTaq d-Tect聚合酶，因此大大简化了MSP的引物设计，使用者可设计仅含一个CpG位点的MSP引物用于MSP实验。EpiTect MethyLight PCR Kits 加 EpiTect MethyLight Assays的组合，则以探针法实现了高灵敏度且可靠的CpG位点定量分析。

而焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为一种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测，为甲基化研究提供了新的途径。Pyro 焦磷酸测序平台使得QIAGEN 的DNA 甲基化流程更加完善，在CpG 位点甲基化程度检测方面，它能提供高精确，高灵敏度的实验结果，同时提供序列信息。

通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率，焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中，根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T 比例。因此，不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据，甲基化状态也就以序列形式呈现。

这种方法的其他优势还包括以结果的序列背景来提供内置的质量控制，以及可将结果与预期的甲基化水平进行比较的能力。亚硫酸氢盐处理的内置对照省去了人工评估未转化的DNA 水平，并预防了假阳性甲基化检测，从而确保了结果的可靠性。

这些特征让焦磷酸测序成为DNA 甲基化分析的金标准。此项技术已经用在：DNA 甲基化与肿瘤类型和基因表达相关联的研究，测量去甲基试剂处理后的细胞反应，以及评估与肿瘤发生、遗传印记和暴露在环境毒素下相关的甲基化状态的变化。

配合焦磷酸测序，QIAGEN新推出了PyroMark CpG Assays。这些预设计的甲基化分析使用特别定制的算法来设计出焦磷酸分析所用的PCR和测序引物，从而实现了基因组内特异靶点的甲基化分析。有了这些分析，你再也不用花很多时间来优化实验，做烦人的troubleshooting，大大提高了分析的成功率。这些引物已经在整个人类基因组中检查过，并以最佳的浓度提供，带来了很好的PCR特异性。再加上PyroMark产品线上的其他产品如PCR和测序试剂，PyroMark CpG Assays扩展了焦磷酸测序流程，实现了人类基因组上几乎每个CpG岛的甲基化分析。

QIAGEN目前提供三种焦磷酸测序仪器，通量由低到高，适合不同的应用。PyroMark Q24 的强项在于可对多达24个样品进行焦磷酸测序。PyroMark Q24 软件提供三种分析类型，以适应您的研究需求——等位基因定量（AQ）、甲基化分析（CpG）和序列分析（SQA）。因此，在数分钟内您就能鉴定DNA 甲基化模式、定量等位基因频率、检测稀有突变，进行从头测序，检测与特定表型连锁的分子标记，并分析疾病相关突变。如果工作台空间、时间限制以及应用多样性之间的取舍在您的实验室中是个问题，那么PyroMark Q24 提供了能满足多个研究和检测项目需求的最佳方案。

需要大样品量的应用最适合在PyroMark Q96 ID 上进行。这些应用包括微生物鉴定和药物抗性分型，DNA 甲基化水平的群体范围参考，基于基因多态性的系统发育或进化研究，Y 染色体单体型分析，以及线粒体异质性的评估以确定肌病症状的表现。这个多重应用平台具有与PyroMark Q24 相同的多功能性。有了96 孔形式、自动的碱基检出功能，以及甲基化分析和分析设计的专用软件方案，PyroMark Q96 ID 能够处理需要真实序列信息和定量遗传变异的任何研究问题。

在考虑到处理成百上千个样品所需的大量试剂时，运行通量最大化可能会使实验成本变得很高。而PyroMark Q96 MD 装有一台高度灵敏的光检测摄像头，可以在减少试剂量的情况下对少量的DNA模板进行准确测序。这使得焦磷酸测序成为其他任何高通量测序或检测平台的低成本替代。此仪器还有一种全自动的形式——自动化PyroMark Q96 MD。

无论您采用何种流程，选择何种形式的PyroMark系统来推动研究工作进入遗传和表观遗传研究的新境界，您都大可放心，因为您购买的是符合QIAGEN 严格质量标准的可靠而强大的研究工具。（生物通 余亮）