利用两步法小体积移液快速制备梯度稀释的分析即用型微孔板[创新技巧]

Joby Jenkins, Rob Lewis, Tristan Cope, Wayne Bowen
TTP LabTech Ltd, Melbourn Science Park, Melbourn, Hertfordshire, SG8 6EE, UK
 
摘要

绘制待测化合物相对治疗靶点的浓度效应的图谱需要将母液准确稀释。在筛选实验室中，化合物一般是以逐步、连续的方式以恒定的体积将单个母液稀释到微孔板中，最近，一种产生梯度稀释的两步法正变得越来越流行。第一步，制备浓度相差30-100倍的多个母液母液；第二步，不同纳升级体积的母液母液转移到第二个分析微孔板上，用于实验并以此生成“分析即用型”量效曲线。

Mosquito® 是一种小体积液体操作仪器，它融合了低成本的一次性加样针头系统和容积式替换移液方法的优势。Mosquito®，通过与新近开发的大体积分液器模块联用，完全能够利用完整的移液步骤，在384孔板上进行两步法的化合物稀释。或者，Mosquito® 也能在第一步制备多个母液，以供利用声学技术的后续稀释。我们展示了这个方法每小时能制备370块分析微孔板所生成的每条量效曲线，都包含有12个点，跨越6个对数单位。

结论

• 单个平台的两步法稀释免去了整合阶段，能快速制备分析即用型微孔板。
• 快速稀释方法避免了梯度稀释中所见的叠加错误。
• 储存在DMSO中的母液直接稀释并转移到分析微孔板，稳定了浓度连续下降时化合物的溶解度。
• 通过直接分液到含有细胞的分析即用微孔板，无需中途微孔板的梯度稀释过程，即可生成量效曲线。
• 装有大体积分液器模块的mosquito产生的分析即用型量效反映微孔板能满足生物化学和细胞筛选的大部分要求。

1 配有大体积分液器模块的mosquito仪器
 

mosquito® 是一种小体积液体处理仪器，它将低成本的一次性加样针头系统和容积式替换移液方式相结合，来确保零交叉污染。mosquito能够在50 nL-1.2 uL的体积范围内移液，而且没有洗针步骤。

2 生成量效曲线的两步法

第一步- 384孔源板中96种化合物母液母液经过梯度稀释（1.5对数），形成4种母液母液，如10 mM、0.316 mM、10 uM和316 nM。利用大体积分液器模块加入稀释物。

第二步- 从源板中取一定量（500、158和50 nL）的母液，在3块384孔分析即用型量效曲线微孔板上产生11个点、半对数的稀释系列+空白，每块微孔板包含32种化合物。

3 第一步 – 逐步稀释的制备

大体积分液器模块显著扩展了mosquito的液体处理能力，实现了纳升和微升体积相结合的移液步骤。大体积分液器模块能够进行大体积（> 10uL）、非接触式分液，从8个独立通道将溶液分配到mosquito所承载的微孔板。通过常见且简单的用户界面，可在同一过程中进行低体积和高体积的分液步骤。两种组件都与水溶剂和DMSO溶剂完全兼容。

在逐步稀释时，可利用小体积微量移液器进行母液转移，并用大体积分液器模块进行稀释物添加。此处所描述的方案，384孔源板中排列的96种化合物每个步骤稀释3次。

• 取最高母液浓度（100% DMSO）的96种化合物各35 uL，置于第1、5、9、13、17和21列。
• 利用mosquito转移所有化合物各1108 nL至相邻的列。
• 大体积分液器模块向这些列中加入34 uL 100% DMSO，并瞬间搅动混匀，从而将化合物稀释31.6倍（1.5个对数单位）。
• 以上过程重复两次，产生4个由100% DMSO稀释的母液，作为源板，进行第二步的直接稀释。
• 此过程约需4分钟即可完成。

4 第二步 – 生成量效曲线的直接分液方法

• mosquito分别转移500 nL、158 nL及50 nL最高浓度的化合物母液到384孔分析微孔板的第1至3列。
• 其它三种母液也如此操作，产生多达12个点、半对数的量效曲线。最后一次稀释可省略，以DMSO溶剂空白作为替代，产生11个点的量效曲线，几乎跨越6个对数单位。
• 分析微孔板上另一边的16种化合物也重复此过程。
• 加入DMSO，让所有孔都补足至500 nL 100% DMSO。
• 此过程约需3.5分钟即可完成，重复三次，完成96种化合物在3块384孔分析即用微孔板上的稀释。

5 直接分液稀释方法的准确性
 

mosquito直接稀释方法避免了梯度稀释误差的叠加。这能够改善重复性，并显著降低传统自动化梯度稀释的误差，在传统自动化梯度稀释中，混合效率有重大的影响。在测试中，所有柱的变异系数（CV）小于8%。图中展示的数据来自荧光素的稀释。
 
6 含有活细胞培养物的微孔板的直接分液稀释

在药物筛选中，贴壁细胞的使用越来越流行，常常需要加入待测化合物，而铺板阻碍了分析即用型微孔板的使用。直接分液稀释克服了这个难题，且不需要去除培养基。举个例子，向384孔板中加入Hela细胞，过夜保证细胞完全贴壁，后用长春碱（G2/M 阻断剂）处理22小时。稀释方法：第1-12列-mosquito直接方法；第13-24列-手工梯度稀释。为了计数，细胞用乙醇固定，并用碘化丙啶（10 M）标记，在Acumen eX3微孔板细胞仪（TTP LabTech）上分析。

索取mosquito液体操作系统的技术资料！

TTP LabTech Ltd.公司的国内联系方式：
名称：TTP LabTech 中国代表处
地址：上海市张江高科技园区蔡伦路７８０号３楼Ｊ座
电话：[phone]
传真: [phone]
邮箱: [e-mail]
网址：www.ttplabtech.com.cn