[新品推荐]轻松，替代繁琐的BrdU：Click-iT EdU

Invtrogen新推出的Click-iT® EdU检测也是以检测新合成DNA中掺入的核苷类似物为基础，但该方法所采用的核苷类似物是EdU，而且不是通过抗体检测，而是基于一个click反应--铜催化的叠氮化物和炔烃之间的共价反应。Click-iT检测避免了BrdU检测所需的苛刻处理条件，可避免DNA变性，维持样本的形态，因而提供了一种更可靠且更简单的方法。

早期测定活性DNA的合成需要在其中掺入放射性的[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷。后来这种方法逐渐被非放射性的核苷类似物溴脱氧尿苷（BrdU）检测所取代，BrdU检测是一种利用抗BrdU抗体对掺入的BrdU进行免疫检测的方法。由于抗体分子量大，难于掺入并被有效检测，因此BrdU检测需采用DNA酶或HCl或加热使DNA变性；这些处理方法会破坏抗原识别位点，此外许多细胞周期分析的染料都需要dsDNA，这种处理方法也使得同一样本无法同时进行细胞周期分析。对于植物细胞等有细胞壁的分析，采用抗体检测还需要消化细胞壁，细胞壁消化酶常含有一些杂质，会导致检测的可靠性降低，同时BrdU检测则需要进行长时间的孵育--几个小时甚至过夜。

Invtrogen新推出的Click-iT® EdU检测也是以检测新合成DNA中掺入的核苷类似物为基础，但该方法所采用的核苷类似物是EdU（5-乙炔-2’-脱氧尿苷），而且不是通过抗体检测，而是基于一个click反应--铜催化的叠氮化物和炔烃之间的共价反应。在Click-iT® EdU检测中，EdU核苷中含有炔烃，而荧光检测试剂含有叠氮化物。荧光叠氮化物（分子量<~1,000）的体积小于抗BrdU抗体（分子量~150,000），这种小分子特性使得EdU可在温和条件下掺入并被有效检测（图1）。Click-iT®检测避免了BrdU检测所需的苛刻处理条件，可避免DNA变性，维持样本的形态，因而提供了一种更可靠且更简单的方法。

图 1. 采用Alexa Fluor®叠氮化物检测掺入的EdU与采用抗BrdU抗体检测掺入的BrdU相比较。
Alexa Fluor®叠氮化物的小分子特性使得DNA无需变性即可让检测试剂与核苷结合。

方法简单 结果出色 耗时更少

高效的Click-iT® EdU实验方案可通过三个简单的步骤完成细胞增殖检测：
1. 用EdU处理细胞。
2. 固定并透化细胞。
3. 用Click-iT® 检测混合物检测30分钟，清洗，然后分析。

采用基于抗体的BrdU检测则需要DNA变性并消化细胞壁，需要进行长时间的孵育--几个小时甚至过夜。细胞壁消化酶常含有一些杂质，会导致检测的可靠性降低。相比之下，采用Click-iT® EdU检测，即便是检测植物细胞，也只需要一个温和的固定和透化步骤，而无需消化细胞壁（图2）。因而细胞壁不再是细胞增殖检测的障碍。对于组织样本采用Click-iT® EdU检测试剂盒只需不到80分钟即可完成，无需二次检测或信号扩增。

图2. EdU直接检测与BrdU间接检测的比较。大鼠静脉注射雌二醇（160 μg/g体重）三天后，采用EdU或BrdU脉冲标记2小时。采用Click-iT® EdU Alexa Fluor® 594成像试剂盒(C10084)中的Alexa Fluor® 594叠氮化物通过click反应（左）或采用抗BrdU抗体和Alexa Fluor® 594羊抗鼠IgG二抗（A21125）（右）检测增殖细胞（以红色标记）。细胞核用蓝色荧光的复染剂Hoechst 33342（H1399）染色。在BrdU检测方法中，采用HCl进行DNA变性导致核信号变弱。

适用于各种平台 任何样本中的新合成DNA检测

Click-iT® EdU细胞增殖检测可以直接并准确地检测出新DNA的合成。这种检测不仅能够测定单个细胞的增殖，还可以通过任何平台（表1）检测出细胞、组织或整个有机体中的增殖细胞（图3，4）。Click-iT® EdU检测也是多重分析的理想选择。检测前只需采取极温和的固定和透化步骤，从而可保护dsDNA和抗原识别位点。尽管我们推荐采用与BrdU正常使用量相等的EdU开始实验，但研究人员通常只需用较少量的EdU或较短的孵育时间，依然可以获得与BrdU检测试剂盒相同甚至更好的信号（图4）。

表1. Click-iT® EdU检测平台

平台	样品数	说明
流式细胞仪	50次检测（每次0.5 mL）	包括可与检测荧光基团同时使用的两种细胞周期染料
高通量成像系统	2 x 96次检测（2块板） 10 x 96次检测（10块板）	包括CellMask™ Blue，用于细胞分割或细胞周期分析
荧光显微镜	50个盖玻片	包括蓝色荧光的细胞核复染剂Hoechst 33342
酶标仪(HTS)	以96孔板形式进行400次检测	比色法或荧光读数。包括终止液，能使信号稳定达24小时
* 2块板检测。† 10块板检测。

图3. 斑马鱼幼虫中肠横切面图。用400 μM EdU对5天大的斑马鱼幼虫进行长达16小时的脉冲标记，然后固定、用石蜡包埋，切成7 μm的切片后处理，再利用Click-iT® EdU Alexa Fluor® 488成像试剂盒（C10337）检测。用Alexa Fluor® 568大豆凝集素（SBA）和TO-PRO®-3染料（T3605）先后对其染色。增殖的细胞核经Alexa Fluor® 488叠氮化物（绿色）和TO-PRO®-3染料（蓝色）标记后呈白色。肠球中的杯状细胞经Alexa Fluor® 568 SBA标记后呈红色。采用共聚焦显微镜上的CoolSNAP™照相机（Princeton Instruments）捕捉20x z-切面图，然后用Photoshop®软件（Adobe, Inc.）处理（包括伪彩色）。图片由俄勒冈大学分子生物学研究所的Sarah Cheesman提供。

图4. 采用Click-iT® EdU试剂获得的结果一般优于BrdU检测的结果。(A) 采用新型Click-iT® EdU检测方法获得的结果，显示了Click-iT® Alexa Fluor® 488叠氮化物与7-AAD细胞周期染色对比的双参数曲线图。(B) 采用标准酸变性法对掺入的BrdU进行基于抗体检测的结果，显示了抗BrdU Alexa Fluor® 488与7-AAD细胞周期染色对比的双参数曲线图。

真正无忧的细胞增殖检测

→ 无需抗体，无放射性

→ 避免DNA变性，可维持样本的形态

→ 体验简化、可靠的检测

→ 适合所有平台或样品使用

Click-iT® EdU细胞增殖检测适用于新合成DNA的检测和定量，比传统的检测方法更胜一筹。

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（感谢Invitrogen供稿。如需投稿，请发送至投稿邮箱[e-mail]）