新技术实时观测丙型肝炎病毒感染

【字体: 时间:2010年04月20日 来源:生物通

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  为了更好地监控丙型肝炎病毒的感染,美国洛克菲勒大学Charles Rice领导的研究小组开发出一种报告系统,能实时观测活细胞中的HCV感染。此系统不需要使用遗传改造的病毒,且非常灵敏,能检测单细胞中的感染事件。

  

丙型肝炎病毒(HCV)感染肝细胞,并引起慢性肝炎。有慢性丙肝病毒感染的人可能毫无异样感觉。然而﹐他们可能发展成肝硬化或在感染多年后转成肝癌。尽管抗病毒药物在某些病人身上证明有效﹐而且能够康复,但是在多数情况下﹐只有短暂效果或完全没有功效。

如同其它病毒一样,如果能建立一个系统,在细胞培养物中繁殖这种病原体,那对于更好地了解丙型肝炎,并加速抗病毒疗法的开发是大有裨益的。可惜,培养HCV是非常困难的。即使世界上有大约2亿人被感染,也仅有一个分离株能在细胞培养中繁殖,而无需获得适应性突变体。因此,目前绝大部分的HCV研究都是基于这一株以及来源于肝癌的特定细胞系。

为了更好地监控感染,美国洛克菲勒大学Charles Rice领导的研究小组开发出一种报告系统,能实时观测活细胞中的HCV感染。此系统不需要使用遗传改造的病毒,且非常灵敏,能检测单细胞中的感染事件。

这种新开发的报告系统是基于病毒蛋白酶NS3-4A对细胞靶点IPS-1的活性,IPS-1靶点位于线粒体上。研究人员将蛋白酶识别位点与绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白融合,并加上了线粒体定位的信号肽,这样,当重组子引入细胞时,线粒体被荧光标记。一旦HCV感染,病毒蛋白酶切割嵌合蛋白,并释放出荧光信号。

图1. 在HCV感染的细胞中(右),改造的荧光蛋白底物被病毒蛋白酶切割,导致报告基团从线粒体转位到细胞核。图像来自Charles Rice和Christopher Jones。

这种报告系统的可靠信号来源于NS3-4A切割的效率以及底物的高组成型表达,让很少量的病毒也能观察到。此外,红色变异体还包含了核定位序列,这样一旦病毒诱导蛋白水解,荧光就移向细胞核。研究人员表示,这种核转位增加了观测,并帮助在原代细胞中检测HCV复制。

在过去,人原代肝细胞中的HCV感染研究是非常具有挑战性的。Rice等利用报告系统的灵敏度,以及最近报道的共培养平台,首次观察了原代肝细胞的HCV感染。

研究小组将利用这项技术,来研究病毒-宿主的相互作用,以及病毒扩散的机制。他们正在开展的一项实验是将报告系统与激光捕获显微镜结合。这些实验将鉴定并分理处感染和未感染的细胞,并比较转录水平。通过这些,研究人员旨在了解更多引起病毒感染的细胞生物学变化,从而探索出干扰病毒-宿主相互作用的新途径。

这个报告系统还能用在从感染个体中筛选出新的感染分离株,有望扩展目前的HCV培养系统。(生物通 余亮)

原文阅读:

Real-time imaging of hepatitis C virus infection using a fluorescent cell-based reporter system

Nature Biotechnology 28, 167–171 (2010) doi:10.1038/nbt.1604

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