GST融合表达全攻略之纯化[选购宝典]

GST标签蛋白可通过亲和层析，利用固定在基质上的谷胱甘肽从例如细菌裂解液中轻松纯化。GST与谷胱甘肽之间的高特异性确保了单个步骤就能获得高纯度。洗脱在温和、非变性的条件下进行，因此保留了蛋白的抗原性和功能。

通用电气医疗集团现有多种亲和纯化产品。Glutathione Sepharose填料（表1）也有多种形式，从预填充的MultiTrap™ 96孔过滤板到预装柱的SpinTrap™、GraviTrap™、HiTrap™及HiPrep™柱，或实验室包装（填料包装的体积从25 ml到500 ml）。不同的形式提供了从微克到克规模的样品的纯化选择。

表1. Glutathione Sepharose填料的特征

1 每毫升填料结合的重组谷胱甘肽硫转移酶。GST蛋白的结合取决于上样样品中蛋白的大小、构象和浓度。GST与谷胱甘肽的结合也是流速依赖的，低流速通常会提高结合能力。这对于上样过程很重要。蛋白性质、pH和温度，以及使用过的填料也会影响结合能力。

2 室温下的水。

仪器的选择将取决于特定的纯化。在利用微型离心柱时洗脱在台式离心机中进行，或利用重力流柱手动进行，或利用蠕动泵或注射器再加上预填充的GSTrap柱进行分步梯度洗脱。GST MultiTrap 96孔板是为小体积的高通量筛选而设计的，每孔能纯化多达～500 μg GST标签蛋白。每根GST SpinTrap柱能纯化多达500 μg蛋白。对于更大量的纯化，预装柱如GST GraviTrap、GSTrap和GSTPrep 16/10则提供了卓越的形式。

GST SpinTrap柱
GST SpinTrap 柱非常适合放大之前的表达水平及纯化条件的筛选。柱的设计可用于微型离心机。每根柱子含有50 μl Glutathione Sepharose 4B，足够纯化最多500 μg重组GST。柱子在含有0.05% Kathon™（一种抗菌的防腐剂）的1×PBS缓冲液中经过了预平衡。每个包装含有50根柱子。

随机选择大肠杆菌转化物，这些转化物中含有表达带GST标签的人肌红蛋白的cDNA，之后表达，并用GST SpinTrap柱进行纯化。人肌红蛋白的cDNA与线性化的pGEX-5X-1连接，并转化大肠杆菌BL21细胞。24个随机选择的克隆接种到3 ml 培养基中，过夜培养。用IPTG诱导表达2小时。取每个培养物1.5 ml，通过反复冻融步骤制备裂解液，再上样到GST SpinTrap柱中。取每种还原型谷胱甘肽洗脱液的等份，上样到SDS凝胶中，用于SDS-PAGE的分析（图1）。结果显示，24个转化物中的7个表达了带GST标签的肌红蛋白。

图1. 筛选24个随机选择的含有表达带GST标签的人肌红蛋白的cDNA的大肠杆菌转化物，将洗脱液进行SDS-PAGE分析。M = LMW-SDS Marker Kit。1-24泳道含有利用还原型谷胱甘肽从GST SpinTrap柱上洗脱下来的产物。

GST GraviTrap柱
GST GraviTrap是方便的一次性柱子，其中预装了2 ml Glutathione Sepharose 4B，足够纯化最多20 mg GST标签蛋白。每个包装含有10根预装柱，是由生物兼容的聚丙烯制造的。特殊的釉料保护填料在纯化过程中不会变干。GST GraviTrap柱在送达时的包装可便利地转化成柱子支架（Workmate）。产品包装中的塑料托盘可用于收集废液。当处理体积超过10 ml时，将Labmate™ PD-10 Buffer Reservoir与柱子连接，能将上样量增加至大约35 ml。

GST Bulk试剂盒
GST Bulk试剂盒含有10 ml大包装的Glutathione Sepharose 4B和5根一次性的柱子。有了这个试剂盒，GST标签蛋白可利用柱层析或分批法进行纯化。GST Bulk试剂盒含有足够的试剂，能纯化最多50 mg GST标签蛋白。

GST MultiTrap 96孔过滤板
GST MultiTrap 96孔过滤板目前有两种选择：GST MultiTrap FF和GST MultiTrap 4B，分别预装了Glutathione Sepharose 4 Fast Flow和Glutathione Sepharose 4B。两种产品都能提供高重复性、高通量的筛选，从不澄清或澄清的样品中小规模快速纯化GST标签蛋白。典型的应用包括不同重组子的表达筛选，蛋白可溶性的筛选，以及小规模平行纯化条件的优化。利用GST MultiTrap可直接从不澄清的细胞裂解液中纯化最多500 μg GST标签蛋白/孔，缩短了操作时间，将敏感目的蛋白的降解降至最低。96孔板形式具有很大的灵活性，可与自动化的机器人系统共同使用，也可通过离心或抽真空手工操作。孔与孔之见、板与板之间的一致性能确保了高重复性。

利用GST MultiTrap FF来设计缓冲液筛选研究，确定纯化GST-海马钙结合蛋白的最佳缓冲液条件。检测的参数有缓冲液、pH、氯化钠、甘油、DTT和谷胱甘肽。同时还进行了超声破碎与市售细胞裂解试剂盒的使用效果比较。利用MODDE™软件（Umetrics）来进行因子设计（实验设计）和统计分析。不同缓冲液条件和样品制备方法随机应用到过滤板中。

样品、结合缓冲液或洗涤缓冲液中谷胱甘肽的存在显著降低了纯化的GST-海马钙结合蛋白的产量，而缓冲液对产量无影响。低pH改善了产量，而pH和添加剂如DTT、甘油或氯化钠未显著影响纯度（图2）。

筛选结果表明，对于GST-海马钙结合蛋白的纯化，获得最高产量和纯度的缓冲液条件是介于10到20 mM的磷酸钠，140到400 mM的NaCl，pH 6.2-7.4。样品制备可通过市售的细胞裂解试剂盒及超声破碎来进行，不会显著影响纯化结果。

图2. 将GST MultiTrap FF过滤板的一些孔中收集而来的GST-海马钙结合蛋白的洗脱组分进行SDS-PAGE（还原条件，ExcelGel™ SDS Gradient 8–18；考马斯蓝染色）。

GST缓冲液试剂盒
GST缓冲液试剂盒含有纯化GST标签蛋白所使用的结合及洗脱缓冲液的储备溶液。试剂盒省去了耗时的缓冲液制备，促进了快速、便利且重现性好的纯化工作。足够的试剂可纯化最多20 mg GST标签蛋白。GST缓冲液试剂盒含有10×PBS，还原型谷胱甘肽、稀释缓冲液和操作指南小册子。

蛋白纯化的放大

纯化过程可轻松放大；Glutathione Sepharose 4 Fast Flow、Glutathione Sepharose 4B 及 Glutathione Sepharose High Performance都有更大的预装柱，以及大包装的填料。推荐增加第二步的凝胶过滤步骤，来精炼目的蛋白，去除可能的聚集物。

GSTrap亲和柱是1 ml和5 ml的HiTrap预装柱，能纯化毫克级的GST标签蛋白。GSTrap柱填充有三种不同的Glutathione Sepharose填料——GSTrap FF、GSTrap 4B和GSTrap HP。利用注射器及提供的连接器，蠕动泵或液相色谱系统如ÄKTA™ design，可进行样品上样、洗涤和洗脱。

GSTprep FF 16/20是预装了Glutathione Sepharose 4 Fast Flow的20 ml Hiprep柱，可用于毫克至克规模的GST标签蛋白的纯化。