专访方勤：Cell文章中的病毒学突破性发现

　　

    最新出版的《Cell》杂志（5月7日）中，由加州大学洛杉矶分校，中科院武汉病毒研究所等单位组成的研究小组的成员获得了病毒学方面的一项突破性发现：他们发现了无包被病毒在入侵细胞的过程中膜穿透蛋白的新机制，这一研究为解析此类病毒入侵细胞的特点，以及相关病毒性疾病的防治提供了重要信息。

    在这项研究中，加州大学洛杉矶分校的研究人员主要承担低温电镜与三维结构重构方面的工作，武汉病毒研究所的研究人员则承担超纯病毒样品的制备及分子生物学工作，为了更深入了解这一研究成果，生物通特采访了武汉病毒研究所主持这项工作的方勤研究员，就读者感兴趣的一些问题请教了她。

    方勤博士领导的研究组主要的研究方向是以水生生物病毒－草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)为研究模型，进行包括人类、哺乳动物、水生动物、植物、昆虫的dsRNA病毒的基因组与衣壳蛋白的结构与功能比较研究，探讨dsRNA病毒内源性转录复制机理以及病毒外衣壳蛋白在侵染过程中与宿主细胞的相互作用。

    一些病毒，比如肠病毒及常见的引发婴幼儿腹泻的轮状病毒，由于没有包被，因此酒精，乙醚等的消除效果不佳，包括一些洗手液也是如此，所以了解这类病毒的侵入机制具有重要的意义，但是对于此类病毒的膜侵入机制，相比于包被病毒，比如流感病毒，科学家们了解的并不多。

    在这一最新的研究中，研究人员采用单颗粒低温电子显微技术（single-particle cryo-electron microscopy），首次获得3.3 Å原子水平的分辨率膜穿透蛋白VP5结构，并且通过分析这一结构，突破性的解析了在病毒入侵细胞过程中膜穿透蛋白的自动裂解是由稳定的休眠状态到起动（priming）状态的转换过程，为分析病毒侵入过程提供了宝贵的研究依据和资料。
 
   研究人员以一种水生呼肠孤病毒（Aquareovirus，Grass Carp Reovirus）为研究对象，通过低温电镜技术构建了感染性亚病毒颗粒（ISVP）包括6个蛋白在内的膜穿透蛋白VP5结构，揭示了病毒入侵细胞过程中膜穿透蛋白的自动裂解是由睡眠状态到priming状态转换的动态过程。

    在这个过程中，研究人员采用了单颗粒低温冷冻电子显微技术，对于这一技术的优点，方勤博士在采访中表示，大分子的晶体结构一般采用X射线衍射技术获得，但体外获得的结晶体并非为物质的自然构像。低温冷冻电镜技术的优点在于能够解析自然状态下物质的天然结构。虽然低温冷冻电镜技术用于生物大分子结构的研究已有十多年的历史，但过去的分辨率一般仅限于分子水平。要达到与晶体结构近似的原子水平分辨率，除低温电镜与重构技术需要改进外，最为关键的环节是超纯度病毒材料的获得。只有在低噪音条件下，才能获得高质量的Image。此外，有关dsRNA膜穿透蛋白的原子结构，已有稳定状态下的晶体结构报道，但要获得亚稳状态下的ISVP膜穿透蛋白结构，用晶体结构很难做到。本文通过低温冷冻电镜技术，在获得高分辨率重构的ISVP结构基础上，解析了ISVP外衣壳蛋白VP5在脱去其保护蛋白VP7动态状态下的原子结构，同时采用生物化学与分子生物学实验验证了其相应的功能。

    病毒入侵研究对于了解病毒传染，疾病防治具有重要的意义。对于这一领域未来的发展趋势，方勤博士也有自己的见解，她认为未来的方向主要是通过揭示无胞膜病毒侵入细胞的分子机制，制定相应的对策，以阻断病毒侵入途径，达到防治病毒感染的目的，要实现这一目标，其研究工作有待进一步深入。

（生物通：王蕾）

原文摘要：

3.3 Å Cryo-EM Structure of a Nonenveloped Virus Reveals a Priming Mechanism for Cell Entry

To achieve cell entry, many nonenveloped viruses must transform from a dormant to a primed state. In contrast to the membrane fusion mechanism of enveloped viruses (e.g., influenza virus), this membrane penetration mechanism is poorly understood. Here, using single-particle cryo-electron microscopy, we report a 3.3 Å structure of the primed, infectious subvirion particle of aquareovirus. The density map reveals side-chain densities of all types of amino acids (except glycine), enabling construction of a full-atom model of the viral particle. Our structure and biochemical results show that priming involves autocleavage of the membrane penetration protein and suggest that Lys84 and Glu76 may facilitate this autocleavage in a nucleophilic attack. We observe a myristoyl group, covalently linked to the N terminus of the penetration protein and embedded in a hydrophobic pocket. These results suggest a well-orchestrated process of nonenveloped virus entry involving autocleavage of the penetration protein prior to exposure of its membrane-insertion finger.

作者简介：

方勤, 女，理学博士，中国科学院武汉病毒研究所研究员，博士生导师。1997-1998，1999年先后在美国匹兹堡大学医学院(University of Pittsburgh, School of Medicine) 分子遗传与生化系及日本大阪大学( University of Osaka) )蛋白质研究所进修学习。2008年在美国加州大学洛杉矶分校（UCLA，MIMG/CNSI）进行dsRNA病毒基因组及病毒结构与功能合作研究。长期以来，主要从事草鱼呼肠孤病毒（GCRV）基础生物学与分子生物学的系统研究；开展过HBV诊断试剂的研制与开发应用，卡波氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）分子流行病学等研究工作。主持承担了国家重点基础研究项目973课题，完成了多项国家自然科学基金资助项目及中国科学院创新课题。在国内外核心刊物发表研究论文50余篇。获国家授权发明专利2项，专著2部。2000年在国际上首次报道GCRV与哺乳动物呼肠孤病毒MRV在基因组水平进化上具有高度的同源性。目前主要研究方向为GCRV衣壳蛋白结构与功能，及病毒非结构蛋白在复制与组装中的功能研究。

近期代表性学术论文 / Selected Publications

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2. Zhu, J.，Cheng, L., Fang, Q., Zhou, Z.H*. & Honig, B*. Building and Refining Protein Models within Cryoelectron Microscopy Density Maps Based on Homology Modeling and Multiscale Structure Refinement. J Mol Biol, 2010(397)835-851.with cover.
3. Cheng Lingpeng, Qin Fang*, Sanket Shah, Ivo C. Atanasov and Z. Hong Zhou*,  Subnanometer-resolution Three-Dimensional Structures of the Grass Carp Reovirus Core and Virion, JMB, 2008, 382：213-222. with cover.
4. Fauziah Mohd Jaafar, -- Qin Fang, -- Houssam Attoui. Complete characterisation of the American grass carp reovirus genome (genus Aquareovirus: family Reoviridae) reveals an evolutionary link between aquareoviruses and coltiviruses. Virology. 2008, 10; 373(2):310-321.
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