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培养细胞的转染优化[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2010年05月19日 来源:Promega

摘要:

  将质粒DNA转染入培养细胞而进行蛋白表达是研究蛋白质功能和监测细胞内事件的一个强有力的工具。如需获得最理想的蛋白表达与细胞活力,则需要优化转染的条件。我们讨论了如何优化使用FuGENE® HD Transfection Reagent的转染条件,并探讨了那些最有可能影响转染成功的因素。

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Trista Schagat & Kevin Kopish
Promega 公司

引言

将DNA转移到哺乳动物细胞内,其成功取决于多种因素,并且具有细胞特异性。常用的或已公布的条件可作为一个指导,但是为了获得最佳结果,我们建议对所有培养细胞的转染条件进行优化。本文中,我们使用FuGENE® HD Transfection Reagent(a)(FuGENE® HD转染试剂)阐述了成功转染的关键步骤以及最初优化转染条件时应当测试的变量。优化不仅仅是让细胞尽可能多地摄取DNA,然后尽可能多地表达蛋白,而是为了在最大限度地表达蛋白与最小限度地影响细胞活力之间找到最佳平衡点。通过优化,你就会对转染细胞实验可能获得的最佳结果有个明确的了解。

成功的关键

许多因素会影响转染的成功以及转染细胞的生物应答。以下每一条因素应予以充分考虑。

细胞健康程度:细胞应处于活跃的分裂期,在新鲜培养基中有规则地传代,并且在转染之前或转染时不应过度融合。最理想的情况是,在收获转染平板时,融合的细胞占总数的75-90%,且95%以上的细胞是有活力的(例如,使用台盼蓝拒染法测试),使用FuGENE® HD Transfection Reagent转染的当天,应当有80%的细胞是融合的。应当监控细胞传代的次数,因为在传代次数极低或极高时,细胞的生物学效应是不可靠的。

DNA质量:应当使用高纯度(A260/A280为1.7–1.9)、低内毒素水平的质粒DNA用于转染,以避免发生非预期的细胞应答,例如细胞毒作用或产生致炎细胞因子。使用专门提取转染级DNA的方法(如PureYield™ Plasmid Purification Systems)制备质粒DNA,将有助于避免遇到这些问题。

转染方法:包括磷酸钙法、脂质体法和电转法。最常用的是脂质体试剂,因为它的毒性最低,并且已经被广泛应用于多种细胞系的转染。这些方法不需要特殊的设备,且基于此类方法的新型试剂仅需向细胞里添加DNA∶脂质体复合物,不需更换细胞培养基。不过,并非所有的试剂都能达到上述程度。即使在最理想的条件下,各个体系下,最大的蛋白表达量和所得到的细胞活力也会有很大差异(图1)。最佳的转染技术是那种蛋白表达量最大,并且几乎不对细胞产生伤害的转染方法。


 
图1.  转染方法影响可最大蛋白表达量与细胞活力

将psiCheck™-2 Vector(Cat.# C8021)瞬时转染到HEK293细胞中,由组成型的SV40启动子驱动前者表达萤光素酶。根据厂家的使用说明书,对三个不同的脂质体转染试剂(A、B与FuGENE® HD)进行优化。细胞活力(使用CellTiter-Fluor™ Viability Assay; Cat.# G6080进行检测)和报告基因活性(使用ONE-Glo™ Luciferase Assay System; Cat.# E6110进行检测)由GloMAX®-Multi Detection System Instrument(Cat.# E7031)进行检测。使每种试剂在最佳条件下使用(这种条件指的是得到的报告基因活性最高且细胞活力损失最小),从而生成数据。数据是重复样品的平均值±平均标准差。对于每个优化实验,至少检测了3种脂质体试剂与DNA的比值和2种细胞密度。

简便性:当转染条件首次优化后,事情就变得简单多了。选择一个容易分析的报告基因,使你能够在由于复杂分析方法而产生的最低可能的复杂性和变异性的情况下,快速对一系列条件进行检测。一旦确定了适于目标细胞系的优化条件后,这些条件就能够应用于你所有的转染实验。如果你使用了一个不同的细胞系,那么你需要再次进行优化。

另一个使其变得简单的建议是平板类型。通常使用96孔板,因为多重变量和重复性能够在单块板上的单个实验中进行检测。小体积可以尽可能地减少培养基和化合物的使用量,灵敏的检测方法能够在单个孔里检测单个或多个报告基因及生物学标志物(1,2)。一旦根据你的细胞类型对条件进行了优化,在进行更大规模的蛋白生产或成像时,就可以根据需要将这些条件扩大到其他孔或瓶的规格。

使用FuGENE® HD转染试剂优化转染条件

对细胞系转染条件的优化应当以经验来决定。这些条件将构成未来许多实验和数据的基础,所以很有必要先花时间学习如何从你的细胞中最大限度地索取。最理想的条件是那些能够给你最大的报告基因活性并且对细胞健康影响最小的条件。

FuGENE® HD转染试剂以脂质体为基础,简单易用,细胞毒性最低,转染效率高。图2中的一个例子显示了使用FuGENE® HD试剂在96孔板中对转染条件的优化。检测变量包括了试剂与DNA的比例以及添加的转染复合物的体积。FuGENE® HD体积与DNA质量的比值(µl/µg)决定了添加到细胞中的复合物的电荷(负电荷DNA必须由阳离子脂质体试剂平衡),该混合物的体积决定了要加入多少DNA。该比值不一定越大越好,太大反而会导致蛋白表达量减少,并对细胞健康产生负面影响(图3)。普遍的比例在1.5:1到4:1之间,每孔加入2–10µl。在这个实验中,HEK-293细胞转染的优化条件是5µl体系,比例为2.5:1。


 
图2 FuGENE® HD转染优化实验

A图  使用FuGENE® HD转染试剂确定最佳转染条件的96孔板布局图。在一块96孔板中,DNA、FuGENE® HD和培养基按照图示的试剂:DNA比例制备成100µl转染混合物。在室温下孵育15分钟后,使用多道移液器将转染混合物添加到转染平板的每个孔中。平板外围的孔中仅包含100µl/孔的培养基。所有其它的孔包含100µl/孔培养有细胞的培养基。第2列:对照细胞分别加入10µl培养基、10µl DNA(培养基中含量为20ng/10µl)或10µl FuGENE® HD 试剂(来自于100µl培养基+8µl FuGENE® HD 试剂)。3-11列:按图示的转染复合物体积与图示的FuGENE® HD试剂:DNA的比例添加到细胞中。B图  优化实验示意图。第1天,平板中接种100µl的培养基或健康的细胞(从一个细胞融合度75-90%的烧瓶中收获)。第2天,将适当的对照物组合起来,将DNA:FuGENE® HD试剂转染复合物按照A图所示添加到细胞中。第3天或第4天,检测细胞活力与报告基因活性。


 
图3 HEK-293细胞转染优化实验

按照图2中建议的实验方案使用FuGENE® HD试剂确定转染HEK-293细胞的优化条件。HEK-293细胞长到85%融合度,然后收获并按照2 × 104 细胞/100µl/孔,将细胞铺在一块96孔板中。第二天,将pGL4.13 Vector(Cat.# E6681,具有组成型的SV40启动子,能表达萤火虫萤光素酶)在100µl无血清培养基(DMEM)中稀释到20 ng/µl,并且与3-8µl FuGENE® HD试剂进行混合以达到图示的试剂:DNA比例。孵育15分钟后,每个孔分别加入2µl, 5µl与10µl。轻轻混匀细胞,然后在37°C, 5% CO2下培养24小时。细胞活力(使用CellTiter-Fluor™ Viability Assay; Cat.# G6080进行检测)和报告基因活性(使用ONE-Glo™ Luciferase Assay System; Cat.# E6110进行检测)由GloMAX®-Multi Detection System Instrument(Cat.# E7031)进行检测。对于每个优化实验,至少检测3种脂质体试剂:DNA的比值和2种细胞密度。数据是重复样品的平均值±SEM。

图2中设计的优化方案与平板布局图可用于检测额外的优化变量。

• 在加入细胞前DNA与FuGENE® HD试剂的孵育期:孵育时间通常是0-15分钟。对于HEK-293细胞,0分钟与30分钟都显示了巨大的细胞活力差异和较低的报告基因活性(数据未列出)。
• 细胞密度:一般来说,我们建议每孔1–2 × 104粘附的细胞或每孔2–10 × 105悬浮的细胞。
• 转染后检测活性的时间:通常来说,在转染与活性检测之间有24到48小时就足够了。最佳时间区间取决于被表达的蛋白,可用的检测灵敏度以及在载体中调控表达的元件。每个表达的蛋白都应该优化时间,并且这一优化也基于特殊的实验需要(如,最小的表达时间或最大的表达量)。

在优化实验中必须包含几个对照。未转染的细胞作为最大细胞活力和无报告基因表达的指标。仅有DNA和仅有FuGENE® HD的对照用于监测转染复合物组分对细胞的任何预料外的影响。

简单优化的叠加

追踪细胞活力和报告基因活性是决定最佳转染条件的关键。报告基因活性高可能会损害细胞健康,而不健康的细胞则不大可能会显示一致的、与生理学相关的生物学反应。

通过使用能在相同的样品中检测的报告基因和细胞活力检测试剂盒能保持优化的简便性。ONE-Glo™ Luciferase Assay System(Cat.# E6110,用于检测萤火虫萤光素酶)和CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assay (Cat.# G6080)就是可兼容检测的范例(3)。将这两个检测进行叠加,报告基因活性和细胞活力都能在一块96孔板中的一个孔内,在一小时内检测完毕。不需要改变培养基,也不需要清洗。

总结

根据经验确定您的细胞类型的转染优化条件,使你能够发挥实验的最大效用。优化的条件将为你提供最大的报告基因活性,同时对细胞健康影响最小,从而能够为后续的操作保持细胞的生物学功能。了解成功的关键,按照一个标准的优化平板布局图,叠加报告基因与细胞活力检测,就能相对轻松地获得最理想的参数。

欲按照这个标准的平板模式快速分析您的优化结果,请浏览www.promega.com/techserv/tools/FuGeneHD/default.htm,使用FuGENE® HD Transfection Reagent Optimization Analysis Worksheet。欲获得已转染不同细胞类型的优化条件列表,请浏览www.promega.com/techserv/tools/FugeneHD/optimization.htm,访问FuGENE® HD Transfection Reagent Protocol Database。

参考文献
1. Hawkins, E. et al. (2002) Dual-Glo™ Luciferase Assay System: Convenient dual reporter measurements in 96- and 384-well plates. Promega Notes 81, 22–26.
2. Fan, F. and Wood, K. (2007) Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev Technol. 5, 127–36.
3. Zakowicz, H. et al. (2008) Measuring cell health and viability sequentially by same-well multiplexing using the GloMax®-Multi Detection System. Promega Notes 99, 25–28.

(感谢Promega供稿,如欲投稿,请发送至ebtservice@sina.com

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