蛋白质组学牛人多篇方法学文章介绍最新技术

　　

生物通报道：来自德国马普生物化学研究所（Max-Planck-Institut for Biochemistry）的Matthias Mann是蛋白质组学研究领域的一位著名科学家，他在蛋白质组学质谱技术研究方面获得了许多重要的突出成果，改进或者发展了各种新型的技术。近期其研究小组在这一领域的方法学方面成果颇丰，相关文章陆续发表在Nature Methods，Cell等杂志上。

在四月份的Nature Methods杂志上，Matthias Mann研究组改进了SILAC方法，从而能检测出人类原发性肿瘤中的蛋白质数量，这对于肿瘤生物学，以及蛋白质生物标记的研究具有重要的意义。

蛋白质组学是大规模研究细胞蛋白质的方法，主要使用质谱技术。通过质谱技术，科学家们已经研制出许多测量生物样品中蛋白质数量的方法，其中一种方法名为稳定同位素标记氨基酸培养（stable isotope labeling with amino acids in cell culture, SILAC）。

SILAC是由Matthias Mann在2008年发明，当年的研究表明，SILAC能用于整个小鼠的同位素标记，研究细胞周期中磷酸化的动力学，以及microRNA对胞内蛋白质组的影响，并比较了单倍体和二倍体酵母的蛋白质组。

这一技术的原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定。

英德两国的科学家利用SILAC技术检验上千个蛋白表达情况与转染的miRNA或是内生的miRNA相对应的关系。研究结果证实，单个的miRNA可抑制上百个蛋白的表达，但是单个的miRNA对蛋白表达的调控并不是直接作用的。大量已知的miRNA结合位点比如seed sequence都参与人类蛋白表达的调控过程。

但是这一方法在持续使用的过程中，研究人员发现使用SILAC，生物样品中的蛋白质被含有“重同位素”的氨基酸所标记，这种被标记的蛋白质在质谱仪中被去除，因此可与未标记的样品进行比较。这种方法需要非常精确的量化分析，但是这种方法只适用于能够完全被重氨基酸所代谢标记的组织或细胞。

因此Matthias Mann对这一方法进行了进一步的改进，从而使之能测出人类原发性肿瘤中的蛋白质数量，而这种肿瘤本身不能被代谢标识。包括肿瘤在内的人类组织是由许多种类的细胞组成，它们能在不同水平上表达蛋白质。为了代表取自特定肿瘤中的许多不同类型的细胞和蛋白质，研究小组用重氨基酸标识了含有不同永生人类癌症细胞系的混合物。采用这种超级SILAC方法，他们精确测出人类肿瘤组织中的蛋白质数量，包括乳腺癌和脑癌组织。

另外Matthias Mann还利用这一方法成果的获得了全面的干细胞蛋白质图谱，鉴定出胚胎干细胞中出现的超过5000种蛋白质，这个数量是以前研究结果的三倍，是目前为止制作出的最大的蛋白质图谱。

干细胞在生物学和医疗方面有巨大的应用潜力，但是它们如何运作并转变为其他细胞仍然存在很多未知问题。为了帮助解决这些问题，研究者们采用了一个“巨型图谱”的方法，他们鉴定了所有在干细胞中表达的蛋白质。

目前，在干细胞中大约鉴定出1700种蛋白质。而这一方法则定量了5111种小鼠干细胞蛋白质。和预期一致，这些蛋白质中的一大部分都参与细胞的快速增殖，但全部蛋白质组涵盖了广泛的细胞功能。这项研究有助于促进干细胞生物学研究发现新的线索，鉴于干细胞中至少表达了所有已知小鼠蛋白质的25%，这项研究体现出了这些重要细胞的复杂性。

蛋白质组学正逐渐转变成一种工具，让科学家们在蛋白质水平解决如干细胞、信号通路等研究中更多富有挑战性的问题。并且许多科学家也越来越关注所谓的亚细胞蛋白质组学，这一领域主要目标是要对细胞器官中的蛋白质组分进行图谱绘制和索引建立。

生物细胞绝不仅仅简单地是由一堆蛋白质组成的，虽然这种想法有时候看起来会便于理解。每一个细胞由几十种功能各异的结构单元组成，而且广为人知的是，高尔基体、线粒体和其它种类的细胞器官，每一种都具有独特的蛋白质组构成特征。

为了能完整地将各单个细胞器官类型分离开来并对它们的蛋白质组成进行分析，Matthias Mann开发出了一种称为蛋白相互关系分析法(PCP)的新技术。利用这种技术，研究者把根据成份分离细胞提取物获得的质谱仪数据与那些已知的定位于特定细胞器官的蛋白质相对比，从而使得研究者能有把握地把细胞器官与特定的片段对号入座。Mann及其同事对小鼠肝脏提取物进行PCP实验，所获得的数据足以使将近1500个蛋白质与10个细胞器官联系起来。Mann领导的国际小组利用这些数据不仅仅推进了有关绘制更为完善的细胞蛋白质组图的工作，而且，对于特定细胞器官顺式元件的初步鉴定和协同基因网络的临时组装这些目标，也被证明是有用的。

过去，技术局限已经给这类研究放置了一个严重障碍。Mann根据自己的研究，认为在很大程度上决定数据质量的关键在于所使用的实验设备。“我们使用的实验设备是非常新的，”他说，“因此，我们能够得到更为精确的实验数据” 。编排权威性的细胞器官蛋白质组索引要求付出更多的努力，包括强有力的计算工具用来最大化地开发这些数据的价值。

除此之外，Matthias Mann在反向ChIP技术研究方面也获得了一些进展。染色质免疫沉淀作用（ChIP），采用一个转录因子——DNA结合蛋白质与抗体相结合，如，研究人员可以分离与因子结合的染色质片断。可以通过实时PCR或DNA微阵列检测那些片断，它们代表了转录因子的活性，即全基因组的“快照”。

而蛋白组学研究采用的是反向方法，先用一个特殊的DNA序列作为寻找蛋白质的诱饵；然后用ChIP去证实：那些蛋白质就是在体内与DNA序列相关联的蛋白质。但是ChIP最大的局限性在于它只能够提供DNA和沉淀实验中预选蛋白之间的作用信息。

为了解决这一难题，Matthias Mann研究开发一种鉴定染色蛋白结合的无偏性方法，为了消除背景，Mann采用了SILAC的方法。他们在含有未经或者经过重氢标记赖氨酸的培养基中进行细胞培养，然而从同位素标记的细胞中利用特异性的DNA探针纯化染色质，或者利用对照探针从未经标记的样品中进行纯化。他们再用SDS-PAGE凝胶电泳分离不同的结合蛋白，并最后用质谱法进行分析。任何蛋白质结合同位素和非同位素标记的比例为1:1时就可以认为是检测背景，其应该是被非特异性探针结合后分离出来的。

但是，Mann并没有因其方法的成功而满足，他设想直接对探针结合的上百个蛋白进行高通量的质谱分析，他使用了Thermo Fisher Scientific公司的一种高效质谱仪，它可以快速而且灵敏地进行检测，包括了一些丰度较低的蛋白。而且，Mann发现可以将这一方法用于基因组相关的扩展研究，比如特定疾病的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）。Mann建议分别合成疾病相关的SNP探针和对照SNP探针，然后利用SILAC实验寻找与其相关的特异性转录因子或抑制因子。

蛋白质组学正逐渐转变成一种工具，让科学家们在蛋白质水平解决如干细胞、信号通路等研究中更多富有挑战性的问题。相信在不远的未来，蛋白质组学与其它学科的相互渗透将会给生命科学研究领域带来全新的突破。

（生物通：万纹）

原文摘要：

Super-SILAC mix for quantitative proteomics of human tumor tissue

We describe a method to accurately quantify human tumor proteomes by combining a mixture of five stable-isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC)-labeled cell lines with human carcinoma tissue. This generated hundreds of thousands of isotopically labeled peptides in appropriate amounts to serve as internal standards for mass spectrometry–based analysis. By decoupling the labeling from the measurement, this super-SILAC method broadens the scope of SILAC-based proteomics.

SILAC-labeling and proteome quantitation of mouse embryonic stem cells to a depth of 5111

Embryonic stem (ES) cells are pluripotent cells isolated from mammalian preimplantation embryos. They are capable of differentiating into all cell types and therefore hold great promise in regenerative medicine. Here we show that murine ES cells can be fully SILAC-labeled when grown feeder-free during the last phase of cell culture. We fractionated the SILAC-labeled ES cell proteome by one dimensional gel electrophoresis and by isoelectric focusing of peptides. High resolution analysis on a linear ion trap-orbitrap instrument (LTQ-Orbitrap) at sub-ppm mass accuracy resulted in confident identification and quantitation of more than 5,000 distinct proteins. This is the largest quantified proteome reported to date and contains prominent stem cell markers such as Oct4, Nanog, Sox2 and Utf1 along with the embryonic form of Ras (ERas). We also quantify the proportion of the ES cell proteome present in cytosolic, nucleoplasmic and membrane/chromatin fractions. We compared two different preparation approaches - cell fractionation followed by 1D gel separation and in-solution digestion of total cell lysate combined by isoelectric focusing, and found comparable proteome coverage with no apparent bias for any functional protein classes for either approach. Bioinformatic analysis of the ES cell proteome reveals a broad distribution of cellular functions with overrepresentation of proteins involved in proliferation. We compare the proteome with a recently published map of chromatin states of promoters in ES cells and find excellent correlation between protein expression and the presence of active and repressive chromatin marks.