Nature Methods：大鼠干细胞技术新进展

　　

生物通报道：2008年Science杂志发布了美国南加州大学研究小组的最新成果：首次成功地从大鼠胚胎中提取干细胞，这是干细胞研究领域的一项重大进展，因为大鼠是继小鼠之后第二个能够分离出具有生殖潜能的胚胎干细胞的物种。

近期来自美国德州西南医学中心的研究人员获得了这种模式动物的最新干细胞研究技术成果，他们创造了35个新型大鼠品系，每一种品系中都包含一种特异性的突变，有助于科学家们分析人类的疾病，比如癌症，糖尿病，阿兹海默症，生物钟紊乱和精神等方面的疾病。这一研究成果公布在Nature Methods杂志上。

胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）是指当受精卵分裂发育成囊胚时内细胞团（Inner Cell Mass）的细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞，之后密苏里的研究人员又通过鼠胚细胞移植技术，使瘫痪的猫恢复了部分肢体活动能力。

但是当研究人员希望建立大鼠ES细胞的时候，却遇到了技术壁垒：传统用于获得小鼠胚胎干细胞的方法不能用于大鼠。为了解决这一难题，研究人员进行了系列实验 ，结果发现大鼠胚胎干细胞在存在3i medium的情况下能有效的被分离和培养——3i medium中包含了抑制三种特异性基因信号：GSK3, MEK，FGF受体激酶的分子。这种方法将干细胞与引起其分化成特异性细胞的信号分离了开来，通过阻断这些信号，研究人员就可以从大鼠中分离得到干细胞了。

从目前培养条件来看，小鼠大鼠的胚胎干细胞与人胚胎干细胞存在较大差别。不论在形态学上、基因表达谱上及信号通路方面，人胚胎干细胞更类似于外胚层干细胞EpiSCs(post implantation epiblast derived stem cells)，即胚胎干细胞发育的下一个阶段。目前的人胚胎干细胞与小鼠大鼠胚胎干细胞是处于不同发育阶段的细胞，其可比性有待进一步研究，所以小鼠大鼠上获得的研究成果在人胚胎干细胞上的应用十分有限。

但是大鼠在干细胞研究方面具有重要的意义，尽管其它物种，包括人类和猴，也有分离出胚胎干细胞样细胞的报告，但由于缺乏确定的全能性金标准——嵌合体证据，这些胚胎干细胞样细胞的全能性仍然是争论的主题，因此突破大鼠干细胞研究的障碍对于其它物种干细胞的研究也具有重要的意义，比如比较大鼠胚胎干细胞和iPS细胞可能有助于了解一些重编程的机理，就像比较小鼠胚胎干细胞和小鼠iPS细胞的那样。

这些之前的研究是一项巨大的跨越，而最新的研究则是走出了第二步。

在最新的研究中，西南医学中心药理系助理教授Kent Hamra等人改造并获得了带有不同突变的大鼠品系，为分析人类的疾病，比如癌症，糖尿病，阿兹海默症，生物钟紊乱和精神等方面的疾病提供了又一重要的模型。Kent Hamra表示获得易操作，可靠并且便宜的遗传改造大鼠能为许多实验室，即使是小实验室，提供无限的医学研究可能，比如说，比较于小树，大鼠是一种体型更大，更聪明的动物，而且大鼠也更加适合于生物化学，药理学和生理学方面的研究，这种动物的行为也与人类更相似。

“我们的研究主要是聚焦在精子细胞生物学和生殖基因方面，但是我们现在认为其他的科研人员也可以利用这些相对简单，低成本的技术来获得一些与人类疾病实验相关的遗传改造大鼠。”

获得突变大鼠的一项关键技术就是由Hamra博士和他的同事历经5年时间研发出来的新技术，这种新技术能阻止精子干细胞的前体细胞进行分化成，或者说是成熟变成精子。

Hamra博士说，“之前在培养基中培养精子干细胞是一项巨大的跨越，而我们的实验则是走出了第二步，我们在培养基中获得了遗传改造的这些前体细胞，筛选后引入到雄性大鼠中去。”（如下图所示）

之前的一些方法在培养突变大鼠方面都受阻，是因为这些方法并没有在培养基中操控干细胞，而且遗传学方法通常采用的是小鼠改造胚胎干细胞的方法，这些方法在其它的哺乳动物中不起作用，也包括大鼠。

最新的方法是一种通过实验验证了的能将遗传突变引入哺乳动物干细胞的方法，这种方法并不是来源于小鼠，并且是在培养基中进行预筛选，从而传递给下一代。

这项技术中的另外一个关键技术是由柏林分子分子医学Max-Delbruck中心的Zsuzsanna Izsvák和Zoltán Ivics两位博士完成，他们发展了一种能在哺乳动物DNA的特定区域引发突变的方法，这种方法能调控DNA中称为转座子的片段，Hamra博士说，“转座子是自然界中的一种将DNA从基因组中插入或者删除的简单方法。”

研究人员利用哺乳动物物种中转座子的特性，准确操控基因组中他们需要突变的基因“跳跃”，比如说，研究人员可以将一个转座子控制在可能与疾病相关的基因附近。

目前研究人员除了利用这一技术获得成体动物外，还在发展包含有不同遗传突变的精子干细胞的复杂文库，至今他们已经获得了大约100个不同突变的细胞系。

（生物通：张迪）

原文摘要：

Generating knockout rats by transposon mutagenesis in spermatogonial stem cells
Disrupting genes in the rat on a genome-wide scale will allow the investigation of many biological processes linked to human health. Here we used transposon-mediated mutagenesis to knock out genes in rat spermatogonial stem cells. Given the capacity of the testis to support spermatogenesis from thousands of transplanted, genetically manipulated spermatogonia, this approach paves a way for high-throughput functional genomic studies in the laboratory rat.

附：

Cell：科学家首次成功提取大鼠胚胎干细胞

一个科研小组12月24日宣布，他们首次成功地从大鼠胚胎中提取干细胞，这将使科学家借助动物模型更方便地对诸多人类顽疾进行研究。

英国科学家马丁·埃文斯早在1981年就成功地从小鼠胚胎中提取出第一个小鼠胚胎干细胞。但大鼠胚胎干细胞的提取尚属首次。

研究负责人、华人科学家应其龙在新闻公报中说，这是干细胞研究领域的一项重大进展，“因为我们知道，与小鼠相比，大鼠在生物学的许多方面与人类更为相近”。应其龙认为，提取大鼠胚胎干细胞研究被证实可行之后，世界许多干细胞实验室的研究方向都将因此而改变。

此前，科研人员尝试提取大鼠胚胎干细胞都因为技术障碍宣告失败。此次，应其龙的科研小组采取了一种特殊的“信号阻断”方法，他们利用特殊的分子抑制大鼠胚胎中3个特定基因发出信号。正常情况下，这3个基因发出的信号是胚胎干细胞分化的“命令”。信号被阻断后，大鼠胚胎干细胞就能够“停下分化的脚步”，保持在原始胚胎阶段。

科研小组认为，能够提取大鼠胚胎干细胞，朝着今后科学家通过基因敲除技术人为地给大鼠胚胎剔除一个或多个基因、培养“定制”大鼠进行疾病研究又向前迈进了一步。

这一成果将发表在定于12月26日出版的《细胞》杂志上。