原位微量PicoGreen法定量DNA浓度[创新技巧]

BioTek公司的Take3(TM)超微量多体积检测板是一个非常灵活的应用工具，可以用于全光谱的吸收光读数，广泛覆盖了吸收光检测的各项应用，同时可以灵活控制样品的体积，并在微孔板检测仪上进行相关定量检测。本文介绍了BioTek Take3超微量多体积检测板的新应用。

Peter Brescia, MSc. and Peter Banks, Ph.D., BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT

介绍

BioTek公司的Take3(TM)超微量多体积检测板是一个非常灵活的应用工具，可以用于全光谱的吸收光读数，广泛覆盖了吸收光检测的各项应用，同时可以灵活控制样品的体积，并在微孔板检测仪上进行相关定量检测。微量未经稀释的DNA，RNA以及蛋白样品的定量目前主要是通过原始吸收光测定来完成的。通过Take3模块，用户可以进行16个体积为2ul样品的吸收光检测，并保证优异的准确性和精确性。对于测序、qPCR以及蛋白分析等下游工作，需要进行快速微量核酸蛋白样品定量的客户来说，Take3是个非常好的辅助检测工具。

Take3板同时还可以完成基于比色法的检测分析。微量检测板既可以作为反应容器也可以作为样品检测容器，因此既可以简化流程也可以节省样品。实验证明在Take3上原位完成检测与传统在其他容器中反应过后加样检测的流程相比，可以明显提高检测的准确性。

本文介绍了使用Take3板进行微量荧光DNA定量的方法。实验中我们使用SynergyTM多功能微孔板检测仪进行最终检测，采用Quant-iT PicoGreen荧光检测试剂进行标记，探讨DNA定量的线性范围和最低检测浓度。

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材料和方法

材料
Quant-iT PicoGreen dsDNA定量试剂盒购于Life Technologies，Molecular Probes Division（Eugene, OR, PN-P7589）。PicoGreen试剂新鲜配制，使用15ul TE缓冲液稀释，避光保存，并于2小时内使用。 DNA标准，来源于青鱼卵dsDNA(Sigma,PN-A3294)。储存于TE 缓冲液中(tris-EDTA, pH7.0)。

方法
所有PicoGreen反应和检测均在Take3板上完成。操作方法与之前介绍的原位法BCA蛋白定量相似。图1显示了操作流程和Take3板上的排布方法。简而言之，将2ul的标准品和未知样品分别加到Take3板的相应检测点位上。然后在相同位置上分别加入2ul的PicoGreen试剂，使两者比例为1:1，然后用枪头轻轻吹打混匀（注意不要产生气泡）。空白样品为2uL的TE和2uL的PicoGreen试剂加在Take3板上的相应检测点位上，同样方式混匀。然后将Take3板盖合拢，室温下避光孵育5分钟。在SynergyH4的光栅光路和滤光片光路上进行检测或者在SynergyHT进行检测。所有检测均使用Gen5TM软件进行操作和数据分析。所有样品均逐孔进行顶部底部检测，重复2－3次，甲醇拭去样品及残留试剂。

图1：Take3板图中描述了Lambda dsDNA标准品以及4个未知样品的浓度和位置。该图提示6个标准品，双复孔A-F成列排布，原位微量分析浓度范围10-1000ng/mL。

仪器设定和数据分析

Synergy H4全功能微孔板检测仪的双光栅和滤光片光路以及SynergyHT的顶部荧光检测光路用于进行DNA溶液的定量。光栅光路均选择9nm带宽，激发波长495nm，发射波长526nm。Z轴垂直高度设于6mm可获得最好的信噪比（S/N）。滤光片光路选择激发光485/20nm滤光片，发射光选择528/20nm滤光片。所有Synergy检测均采用氙灯光源（滤光片光路采用高能氙灯）。Gen5软件使用自动校准灵敏度收集信号，设定F2:F3（1000ng/mL）孔DNA浓度为最高，对应每点255次检测，相对荧光信号值为60000.

Take3板采用白色特氟龙图层打印膜确定检测微点位置，可以在Synergy光栅光路进行检测。光栅所产生的检测光束横截面小于微点的横截面。对于滤光片系统而言，荧光背景信号高从而降低了检测性能，无法进行低浓度DNA的定量，如果采用黑色特氟龙图层膜，就可以明显降低荧光检测的背景。本文所进行的所有检测均采用黑色特氟龙图层的检测板。

所有DNA检测均使用空白矫正。信噪比（S/N）通过每孔平均荧光信号的标准差扣掉空白值来确定。标准曲线采用线性回归方程。

结果讨论
6个标准品浓度测定的标准曲线确定了PicoGreen分析的DNA定量范围是10-1000ng/mL。图2显示了每种检测光路所得到的标准曲线。除光路不同以外，所有检测均采用方差线性回归分析，R2值均>0.999,n=3. 很明显，从标准曲线的斜率上看，滤光片系统提供了良好的检测灵敏度。

 
图2：SynergyH4、SynergyHT的光栅和滤光片光路的最小方差线性回归分析。误差线代表SEM（n=3）

图3显示了几种光路的标准曲线中每孔DNA浓度的的S/N值。可以看到光栅检测光路在低浓度DNA（≤100ng/mL）检测时S/N明显增高。这时所产生的低背景效果是由于光栅提供了较细的检测光束。由于滤光片系统具有更好的透光效率，因此在较高浓度DNA（≥100ng）时，具有更好的S/N值。

图3：每种光路下采用标准曲线分析DNA浓度时的S/N值。误差线反映了空白孔和DNA检测孔的错误程度（标准差）。

Take3上的16个微量检测通道可以同时满足标准曲线和样品的检测。通过在原位进行加样操作及检测，由于不同孵育时间、温度及不同操作所带来的误差被降低了。按图1中显示的Take3板加样检测顺序，采用SynergyH4的光栅光路对未知低浓度DNA样品（25ng/mL）和高浓度DNA样品（500ng/mL）进行定量获得很好的准确性。两个DNA样品定量的准确性分别是＋1.6%和-3.0%。同理，在Synergy系列微孔板检测仪上均获得相同的检测效果。

结论

Take3超微量多体积检测板可以用于进行低浓度荧光法DNA定量。其DNA定量的最低浓度可以达到ng/mL。这种方法有效的将传统A260吸收光检测的动态范围提高了3个数量级。原位操作的方法，将样品、标准品以及PicoGreen试剂直接加在Take3检测板上，整个操作简单方便节省样品和检测试剂并提高了检测的准确性。Take3可以在全部Synergy产品线上进行微量的样品分析。

参考文献
1. Brescia, P. and Banks, P. Multi-Volume Analysis of Nucleic Acids using the Epoch™ Spectrophotometer System, Winooski, (VT), BioTek Instruments, Inc., Nov, 2009.

2. Brescia, P. and Banks, P. Analytical Performance of Nucleic Acids Micro-Volume Quantifi cation Using the Epoch™ Spectrophotometer System, Winooski, (VT), BioTek Instruments, Inc., Dec, 2009.

3. Brescia, P. and Banks, P. Analytical Performance of Epoch™ Multi-Volume Spectrophotometer System for Protein Quantifi cation, Winooski, (VT), BioTek Instruments, Inc., Jan, 2010.

4. Brescia, P. and Banks, P. In-situ Micro-Volume Bicinchoninic Acid Protein Assay, Winooski, (VT), BioTek Instruments, INC., Feb, 2010.