Methods：干细胞培养新方法

　　

生物通报道：胚胎干细胞 (ES)是一种永生化细胞 ,在适宜培养条件下具有永久的自我更新能力并维持未分化状态、高端粒酶活性、正常核型、胚胎表面标志及多潜能转录因子的表达 ,如SSEA、OCT- 4、Nanog等。ES被认为可以提供一种理想的生物学平台 ,用于多方面的科学研究与临床应用 ,如药物筛选平台的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、基因靶向敲除动物模型的构建、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等。

现有人类胚胎干细胞的培养和诱导分化，都离不开动物源培养基，比如从实验鼠身上分离出来的结缔组织细胞和牛胚胎血清等。选择最优化的细胞培养基对于ES的研究及临床应用是至关重要的，生物通总结了最新的相关培养新方法，希望能帮助有这方面需要的研究人员找到更适合自己实验的培养方法。

多能干细胞培养目前存在一些问题，比如如何培养足够量的多功能干细胞，如何能避免培养人类干细胞的材料发生免疫反应。在培养人类干细胞的材料方面，近期来自麻省理工的研究人员发明了一种合成性基质，这种基质没有外来动物材料，能够使干细胞至少三个月保持活性并自我繁殖。而且，该合成性基质首次使得单细胞能够形成细胞集落。这一成果公布在Nature Materials杂志上。

以往研究表明，基质表面的化学和物理特性，比如粗糙度、硬度、对水的亲和力等对干细胞生长有影响。研究人员创造了500种特性不同的聚合物并在上面培养干细胞，分析每个聚合物上面细胞的生长状况。他们发现，基质表面疏水性对细胞生长有个最佳范围，而表面糙度和硬度则没有太多影响。此外，他们调整最佳聚合物的组成为：高比例的丙烯酸酯，外面包裹玻连蛋白。

应用这种新的培养基质，研究人员成功实现了人类胚胎干细胞持续三个月的生长和分裂，并获得了大量的细胞。他们将进一步研究，争取将这种培养基质应用到其它类细胞。

另外针对如何能够培养足够量的多功能干细胞呢？来自俄亥俄州立大学研究人员研制出一种大批量生产胚胎干细胞（mass-producing embryonic stem cells）的新方法。

用传统的实验室方法生产干细胞不仅价格高，最主要的是不能满足日益增长的对人类胚胎干细胞的需要。研究人员在一种生物反应器（bioreactor）中培养小鼠胚胎干细胞。细胞数量在15天内扩增了193倍，实验尾期的细胞密度——反应器中的细胞数是用实验室传统方法得到的10-100倍，也就意味着多出数亿的干细胞。并且检测结果显示，bioreactor中的干细胞未分化程度更高，寿命更长。这种类型的大批量生产因为需要更少的设备和管理，因此干细胞生产成本降低了80%。

研究人员使用的bioreactor实际上是一种组织生长设备（tissue-growing device），能够用于培养成人干细胞，并且能够使研究人员对培养过程中的每个胚胎干细胞进行紧密跟踪。新型bioreactor有两个格室（chamber），一个格室内包含可以支持干细胞生长的高聚物螺纹，一个格室内含有液态培养基。这种液态培养基能够向干细胞传递炎症因子，维持干细胞未分化状态。

实验过程中，研究人员分别在flask中（传统细胞培养方法）和bioreactor中的标准高聚物螺纹（strands of polymer threads，生物通编者译）上培养小鼠干细胞。用flask和用bioreactor培养干细胞的不同之处在于：细胞在bioreactor中能够向三维空间生长，而在flask的底部平面上只能向二维平面上生长。bioreactor培养的细胞相对于flask培养的细胞寿命长，因为细胞有更多的空间。

研究人员以两种蛋白为指标检测flask和bioreactor得到的细胞（蛋白的出现标志干细胞还没有分化）。检测结果显示，用bioreactor培养的细胞94%呈阳性，用flask培养的细胞85%呈阳性。

除此之外，以色列耶路撒冷哈达萨大学的研究人员开发出一种新的干细胞培养基，能让干细胞在更长时间内不分化。这项研究成果发表在《Nature Biotechnology》上。

为了保持hESC存活且具有多能性，研究人员通常在滋养层细胞（也就是一层小鼠胚胎成纤维细胞）上培养，或者在微载体上成簇培养。但是在这些基质上培养干细胞是相当昂贵的，而且培养物不能在很长时间内保持未分化状态，尽管所有必需的生长因子都存在。

研究人员分析hESC簇分化成神经细胞，他们一直在使用Invitrogen的Neurobasal培养基。这种培养基能够在无滋养层的条件下长时间维持神经细胞的生长和正常表型。在研究过程中，研究人员注意到并非所有细胞都分化了。他们怀疑是培养基的选择导致了这种现象，于是他们开始集中精力研究培养基如何促进干细胞生长并抑制分化。

为了验证他们的理论，研究小组定制了培养基。他们在Neurobasal培养基中加入了血清替代物，还加入了干细胞生长所需的蛋白，包括细胞外基质组分、神经营养因子、成纤维细胞生长因子2和活化素A。研究人员在常规的无血清培养基和定制培养基中培养了hESC。三个星期之后，定制培养基中存在更多的未分化hESC细胞。

使用这种新的培养基，研究小组检验了三种不同的hESC系。他们利用荧光激活细胞分选（FACS）在7周和20周后分析了培养物，发现90%的细胞仍维持多能性。这项突破为在计算机化的自动系统中大规模扩增胚胎干细胞创造了可能性。此外，通过改变培养条件，还可能进一步指导干细胞长成特定的细胞类型，用于研究或病人的移植。

（生物通：万纹）

附：

胚胎干细胞培养标准化操作规程

一般培养——维持ES细胞处于未分化状态
ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。


培养基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注：一瓶DMEM是500ml。

贮存液
DMEM(高糖)
马血清（HS）
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巯基乙醇（55Mm）
PEST
ESGRO

复苏细胞
细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：
1．从液氮中取出一管细胞；
2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；
3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；
5．离心3分钟；
6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；
7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；
8．孵育。

冻存细胞
冻存液
90％HS和10％二甲基亚砜

步骤：
1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；
2．用细胞刮刀收集细胞；
3．将细胞转入15ml Falcon管内并离心3分钟；
4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）
5．分装于冻存管内，每管1ml；
6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。

明胶包被
准备500ml 0.1％明胶溶液
1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.2μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿
1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；
2．置室温30分钟；
3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平方，以免明胶污染盖子和流出培养板。