专访程功 创新研究填补虫媒疾病医学空白

　　

正值蜱虫咬人传播虫媒疾病的季节，大洋彼岸的科学家在类似的虫媒研究方面取得新的进展。来自耶鲁大学的研究团队成功破解西尼罗河病毒的致病机制，相关成果文章公布在最近的《Cell》上。这是科学家们首次破解这个世界性的医学难题。也许，这个新的发现将加快虫媒病毒首个疫苗的出现速度。

文章的第一作者——来自耶鲁大学医学院传染病系的程功博士表示，虫媒病毒传染病是一个世界性的医学难题，包括西尼罗河病毒、登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒等在内的多种虫媒传染性病毒均属于黄病毒（flavivirus）家族，导致全球几亿人感染，并在特定的区域爆发性流行。然而，目前为止，还没有针对虫媒传染病毒的特效药物和疫苗。对于黄病毒与其主要的携带者和传播者——蚊子之间的分子致病机理，仍是医学界的空白。

 
耶鲁大学 程功博士

揭示病毒致病机制　有望制备首个虫媒疫苗
程功所在研究组利用西尼罗河病毒和埃及伊蚊（Aedes aegypti）作为研究模型，发现西尼罗河病毒主要利用蚊子的两种受体蛋白（mosGCTL-1 和mosPTP-1）吸附到细胞表面并进入细胞，完成对细胞的感染过程。其中，mosGCTL-1受体能够被西尼罗河病毒感染诱导表达，大量新产生的受体进一步加速了病毒在蚊子体内的感染进程。这个机制为解释“蚊子是西尼罗河病毒的主要携带者和传播者”这个问题提供了一个新的证据，进而为研究其他虫媒传染病毒的致病机制提供了新的思路。
 

（西尼罗河病毒感染蚊子的致病机制）

目前，没有针对虫媒传染病毒的特效疫苗，杀灭蚊虫仍然是控制虫媒传染病的主要方法，但是，这些病毒的传播仍然有上升趋势。这预示人类需要一种新的方法阻断病毒在自然界的传播。在该项研究中，程功等人的实验结果显示，一种新型“虫媒传播阻断疫苗（transmission blocking vaccine）”能够有效阻断病毒的传播。他们通过免疫蚊子的蛋白，来阻断蚊子从人或动物上获取病毒的能力，从而降低野外携带病毒的蚊子的数量，达到预防病毒的目的。该项研究开辟了一个新的疫苗研制方向。

提出四个创新点  照亮虫媒疾病研究前景
在这个研究中，程功所在课题组取得了四项创新成果：1. 提出一个新的病毒致病机理模型：病毒通过多个受体蛋白吸附到细胞表面，其中关键的可溶性受体（soluble receptor）可以被病毒诱导表达，从而促进感染。这为解释为什么病毒能在动物体内快速传播提供了新的证据。2．建立起一套新的实验检测方法：以往对蚊子和病毒的研究大都集中在细胞水平，但由于蚊子的细胞系极为缺乏，造成了研究的局限性。这项研究完全利用蚊子成虫作为实验对象，为节肢动物体内病毒致病机理研究提供了不受细胞系局限的技术平台。3. 为黄病毒在哺乳动物中致病机理研究提供了新的靶点。4. 找出了西尼罗河病毒在蚊子中的重要受体，为开发一种新型的虫媒传染病疫苗奠定了基础。

攻克技术难点  发现感染蚊子的重要受体
由于蚊子通过吸血途径的病毒感染率比较低，而且不稳定，因此，在该项研究中，如何感染蚊子是非常重要的一环。破解之道是，利用显微注射（micro-injection）的方法将病毒直接注射到蚊子体内。这样，就可以通过荧光定量PCR（QPCR）对蚊子体内的病毒量（virus burden）进行检测。

程功所在课题组于2008年在《Nature》发表一篇文章（Krishnan et al., Nature, 455, 242-245），该文章通过RNAi screening 鉴定出283个人类基因可以促进西尼罗河病毒感染人Hela细胞。根据这些人类基因，程功等人首先找出了215个埃及伊蚊（Aedes aegypti）中的同源基因，之后他们利用QPCR检测了这215个蚊子基因在西尼罗河病毒感染时的表达水平。结果显示，有32个基因的表达被西尼罗河病毒明显调控。下一步，他们利用dsRNA 显微注射将这32个基因分别沉默（RNAi silencing），然后感染西尼罗河病毒，比较基因沉默前后蚊子体内病毒量的变化。结果显示，在这32个基因中，13个基因在沉默后有明显的表型。其中，人 MBL-2的同源基因表型最为明显，该基因被沉默以后，蚊子体内的病毒量剧烈下降。说明这个基因可以强烈促进病毒感染蚊子。因此，这个基因被命名为mosGCTL-1 （mosquito Galactose-specific C-Type Lectin-1）。

在上述研究基础上，程功将这个基因克隆，并在果蝇S2细胞中表达纯化。实验结果显示，mosGCTL-1可以与西尼罗河病毒E蛋白强烈结合。之后，他们将纯化的mosGCTL-1与西尼罗河病毒混合注射到蚊子体内，经与对照组对比，mosGCTL-1注射组的病毒量明显升高，表明mosGCTL-1可以显著促进西尼罗河病毒感染。结合在蚊子血淋巴中IFA的数据，证明mosGCTL-1是西尼罗河病毒感染蚊子的一个重要受体。

由蚊及人  探索人类感染病毒的机制
节肢动物（蚊子）和包括人在内的脊椎动物（鸟、马等）是西尼罗河病毒在自然界中的主要载体。尽管西尼罗河病毒在脊椎动物与节肢动物中的致病机理存在巨大的不同，但仍存在一些必然的联系，因为mosGCTL-1是人 MBL的同源基因，mosPTP-1是人 PTPRC （CD45）的同源基因。在哺乳动物中，MBL与CD45存在相互结合，这种结合在T细胞的成熟中起到关键作用。

程功指出，mosPTP-1是二级受体，与西尼罗河病毒没有直接结合作用，而mosGCTL-1则可被西尼罗河病毒感染诱导。只有当mosGCTL-1存在时，mosPTP-1才能通过mosGCTL-1与西尼罗河病毒结合。由于mosPTP-1在蚊子体内各个组织中存在广泛且高量的表达，因此，这方便了西尼罗河病毒对蚊子细胞的侵染。

哺乳动物与节肢动物在进化上差别很大。在哺乳动物中，CD45特异性地存在于淋巴细胞上，是淋巴细胞的特异性表面蛋白。研究表明，淋巴细胞对西尼罗河病毒的致病非常关键，西尼罗河病毒脑炎就是由感染的淋巴细胞携带病毒穿过血脑屏障造成的。但是，目前还没有数据表明哺乳动物CD45是西尼罗河病毒感染的关键分子。

程功等人的研究为探索黄病毒（flavivirus）对哺乳动物的感染机制提供了新的线索。以往对黄病毒的研究集中于寻找细胞表面受体与病毒的相互作用，迄今仍未发现关键性特异性受体。程功的研究提示，在哺乳动物中很可能也存在相似的通路来促进病毒的感染。病毒通过多个受体结合到细胞表面，其中一个或多个可溶性受体（soluble receptor）在与病毒的结合中起到关键作用。寻找哺乳动物中黄病毒的可溶性受体很可能成为病毒感染机制的下一个热点！

梅花香自苦寒  成功在于坚持
我问程功，研究中遇到的最大困难是什么，他说是对课题的选择和把握。他刚进入Dr. Erol Fikrig的实验室时，虫媒传染病研究对他来说是一个全新的领域。长期以来，对虫媒传染病毒的研究大都集中在哺乳动物上，对病毒与蚊子的关系了解非常少，研究手段贫乏，可以说是医学界的空白。他与Erol讨论认为，作为病毒的主要传染源，蚊子与病毒的关系极为重要，决定突破以前的研究路径，对蚊子的基因进行大规模筛选。该项筛选最终靶定到一个分泌型蛋白mosGCTL-1上，并研究出它与西尼罗河病毒感染高度相关。

任何研究都不会一帆风顺。在进一步寻找另一个细胞膜受体时，程功遇到了很大的困难，这实际上是一个新的致病机制，没有可供参考的思路，课题研究一度停滞不前。此时结题，也可以发表有一定价值的论文，但他与Erol讨论后还是决定知难而进，开辟更多种的研究路径寻找这个受体。终于，他们利用蚊子与哺乳动物的关系，配合基因功能研究，成功地鉴定出mosPTP-1，使得这个课题得以顺利完成。

如果程功当时知难而退、结束研究，那就不会有这篇Cell文章出炉。前事不忘，后事之师，对于这段经历，程功体会颇深：
1． 对科研的敏感。不去跟随别人的脚步，敢于去开创自己的领域；CELL只发表最原创的研究论文，原创性对高档次论文来说极为重要。
2． 对科研执着。不怕困难，迎难而上,且不怕冒风险。原创的工作大都基于一个漂亮的筛选（screening）工作，但是筛选工作有很大的风险性，筛选的结果可能是宝石，也可能是沙粒。这就需要有永不言弃的执着精神和敢于投入的冒险精神。
3． 学科交叉的重要性。程功对蚊子的研究，借鉴了对哺乳动物的很多研究成果，从而为自己的课题研究提供了很多新颖的思路。
4． 努力工作。在课题进展的关键时期，程功坚持每周80小时以上的纯工作时间。在实验间隙，他大量阅读补充文献。对于比较危险的实验工作，还须有为科学献身的精神。程功在BSL-3实验室（Biosafety Level-3，相当与国内的P3实验室）操作蚊子时，被意外叮咬过两次，幸好事后证明是非感染的蚊子。虽然他的课题研究存在一定危险性，但他仍然非常热爱自己的工作。

关于程功

山东省泰安市人。2003年获山东大学理学学士学位，同年保送入复旦大学攻读微生物学博士，师从郑兆鑫教授，于2008年毕业并获复旦大学微生物学博士学位。2008年8月至今，在耶鲁大学医学院传染病系从事博士后研究，于2010年5月获得耶鲁大学“James Hudson Brown-Alexander Brown Coxe Postdoctoral Fellowship”基金支持。

长期从事病毒学相关研究，博士期间课题主要集中于口蹄疫病毒疫苗研制以及家畜干扰素家族功能研究，于《Vaccine》、《FEBS Letters》、《J Interf & Cytok Res》等杂志发表多篇文章，并申请多项专利。博士后期间师从著名传染病学家Erol Fikirg教授（HHMI Investigator）, 对虫媒传染病毒（Arthropod-borne viruses）与虫媒宿主（Arthropod vector）的致病机理进行系统研究。程功等人利用西尼罗河病毒和埃及伊蚊作为模型，第一次揭示了虫媒传染病毒感染蚊子的分子机制。该项研究成果发表于9月3日《Cell》杂志。