新技术：破解RNA测序的方方面面(二)[选购宝典]

生物通报道：RNA测序（RNA-Seq）是一种鉴定并且定量解析样品中所有RNA的重要工具，目前RNA-Seq可以对total RNA样品中所有种类的转录本进行测序和表达谱分析，因此是对RNA进行测序一直以来都被认为是一种发现基因的有效方法，而且还是对编码基因以及非编码基因进行注释的金标准。

目前随着新一代高通量DNA测序技术快速发展，RNA-seq技术的处理能力也逐步增强，目前主要的流程包括，首先，用Poly(T)寡聚核苷酸从总RNA中抽取全部带Poly(A)尾的RNA，其中的主要部分就是编码基因所转录的mRNA将所得RNA 随机打断成片段，再用随机引物和逆转录酶从RNA片段合成cDNA片段。然后，对cDNA 片段进行末端修复并连接测序接头(adapter)，得到将用于测序的cDNA在以上过程，将RNA随机片段化和采用随机引物进行反转录（见下图）。

有时为提高测序效率，还会用电泳切胶法获取长度范围在200bp(±25 bp)的cDNA片段，再通过RCR扩增，得到最终的cDNA文库。

虽然RNA测序技术已经出现了将近20年，但直到最近才开始构建克隆文库。对人类、小鼠以及其它重要模式生物进行全长基因克隆构建的科研项目需要几年的时间才能够完成。但是有了最新的测序技术，我们现在可以只需要花费几天，仅用以往同类项目科研经费的很少一部分就能够得到一个比较满意的完整的细胞转录组。

许多公司都提供了相应的RNA测序服务，比如常见的Illumina/Solexa测序技术（Solexa公司2007年被Illumina公司收购，因此现在通常被称为Illumina/Solexa测序技术）。

Illumina/Solexa新测序技术基本原理是边合成测序(sequencing by synthesis，SBS) ，即测序过程是以DNA单链为模板，在生成互补链时，利用带荧光标记的dNTP发出不同颜色的荧光来确定不同的碱基，新加入dNTP的末端被可逆的保护基团封闭，既保证单次反应只能加入一个碱基，又能在该碱基读取完毕后，将保护基团除去，使得下一个反应可继续进行，为了增加荧光强度，使之更易被成像系统所采集，该技术在测序之前还需要对待测片段做桥式扩增(bridge amplification)。

最开始这一技术只能在较短的测序读长上(20-30 碱基)保证较高的正确率，随着技术的改进，目前的读长已经增加到100碱基以上。同时，随着双端测序(paired-end，PE)技术的成熟，测序长度更可达到单端测序的2倍，测序通量也随之增加。

Illumina/Solexa测序技术能够在单核苷酸水平对任意物种的整体转录活动进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性），提供全面的转录组信息。并且这一方法相对于传统的芯片杂交平台，RNA测序无需预先针对已知序列设计探针，即可对任意物种的整体转录活动进行检测，提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围。

Illumina/Solexa测序平台近期推出了GA(Genome Analyzer)、GAIIx、HiSeq 2000等测序仪，扩充了RNA测序的效率。其中GA(Genome Analyzer)采用的是边合成边测序技术和可逆中止化合物染料技术(Reversible Terminator Chemistry)，提供高通量，高精确度，低成本的基因组测序。利用Illumina GA 测序技术在对基因组进行测序和注释的同时，也可对基因表达调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用展开研究。

GA测序方法的原理与上述基本相同，利用这种方法可以在一个反应中同时加入四个标签，减少因二级结构造成的一段区域的缺失。并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点。

这一方法是一种全新独特的，适用于各个物种的小RNA深度鉴定与定量分析研究平台。通过大量的平行测序，研究人员可以发掘、鉴定并定量出任何物种全基因组水平的小RNA图谱。应用这种低成本快速测定数百万标签序列的新方法，Illumina GA提供了解密小RNA图谱独一无二的方法。目前东盛生物正在进行microRNA测序服务优惠活动，并承诺测序失败不收任何实验费用，如果有相关需要的实验人员，不妨关注下（索要相关的技术资料>> >> ）。

由于llumina/Solexa测序平台得到的读段一般存在片段较短、且插入删除错误较少等特点，如果要想获得表达量较高基因的RNA全长测序，那就可以试一下Roche454的GS FLX，GS FLX 400bp的读长使得它形成较好的contig，但是对低表达丰度的基因，可能需要多次测序才能找到足够的数据。

GS FLX主要适用于非编码区域功能研究（Non-coding RNA研究、microRNA前体研究等）、转录本结构研究（UTR鉴定、Intron边界鉴定、可变剪切研究、Start codon鉴定等）、（基因转录水平研究）和全新转录区域研究。主要技术路线如下：

另外Illumina的GAIIx是一款性价比较高的产品，单次运行能产生50g（年内达到95g）数据通量（GA Ⅱe System则是为中小规模测序设计的，专为中低通量的使用者设计的测序仪），相比之下，HiSeq 2000则是让个体实验室也能承担最大最复杂的测序研究，单次运行产生200g的通量，且试剂成本最低，可处理更多样品及解码更大更复杂基因组。

延伸阅读：

新技术：破解RNA测序的方方面面(一)

（生物通：万纹）