专访金颖研究组：探究干细胞分化的奥秘

　　

生物通报道：来自中科院上海生命科学研究院，上海交通大学医学院健康科学研究所的研究人员筛选到一条在ES细胞分化过程中重要的信号通路calcineurin-NFAT, 并且对其在ES细胞分化和小鼠胚胎早期发育过程中的功能进行了深入研究。这一研究成果于2011年一月发表在干细胞领域国际顶尖期刊《Cell Stem Cell》杂志上。

领导这一研究的是中国科学院干细胞生物学重点实验室金颖研究员，其早年毕业于中国医科大学，在获得北京协和医科大学/中国医学科学院的博士学位后远赴美国求学，曾在美国北德克萨斯州大学医学中心和德克萨斯大学西南医学中心进行博士后研究工作，2000年回国。

金颖研究员的研究组近年来在胚胎干细胞研究领域获得了颇多成果。这项发表于《Cell Stem Cell》杂志上的最新研究成果是由金老师的两名博士研究生，李翔和朱莉莉，主要完成的。其研究成果对ES细胞分化和小鼠胚胎早期发育过程中的功能等干细胞研究基础问题提出了新的看法，有助于更深入的了解ES细胞自我更新与分化。为了详细了解这一成果，生物通特联系了金颖老师，就读者感兴趣的一些问题请教了她的研究组。

生物通：干细胞研究风生水起，然而对于一些比较基础的机制机理问题，目前却了解的不多，贵研究组《Cell Stem Cell》文章解答了胚胎干细胞如何从自我更新向分化状态转变的一个关键信号问题，意义重大，您能谈一下这项研究的研究思路吗，为其他科研人员提供参考？

金老师研究组：胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ES）是由着床前囊胚内细胞团（Inner Cell Mass, ICM）的细胞在体外分离培养所建成的全能性细胞系。它具有自我更新和发育多能性的特点。这两大特性使ES细胞具有极其重要的基础研究价值和巨大的临床应用前景。目前的研究表明， 外源性LIF-STAT3和BMP-SMAD通路对于ES细胞维持自我更新具有至关重要的作用。在没有其他因子存在的无血清培养基中，仅仅添加LIF （leukemia inhibitor factor） 和BMP4 （bone morphogenetic protein 4） 两种因子便可成功的在体外培养ES细胞。然而调控ES细胞胚层分化的分子机制目前研究不是很清楚，研究表明激活ERK-1/2通路可以触发ES细胞进行胚层分化，而抑制这条通路可以不依赖LIF部分维持ES细胞自我更新。但除了ERK-1/2通路以外，是否有其他信号通路参与调控ES细胞胚层分化目前并不清楚。

为了寻找调控ES细胞胚层分化的未知通路，我们应用了PB转座子这一突变筛选工具。我们发现当PB转座子突变ES细胞内源基因Ppp3r1后，在撤去LIF诱导ES细胞分化条件下，ES细胞不进行正常的胚层分化，而能维持自我更新状态。这提示基因Ppp3r1在调控ES细胞胚层分化方面可能有重要作用。Ppp3r1是钙调神经磷酸酶（calcineurin）的一个调节亚基(CnB)。Calcineurin是一个丝、苏氨酸磷酸酶。它可以使下游基因活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells，NFAT )去磷酸化、被激活进入细胞核。 在本文研究中，利用calcineurin-NFAT信号通路抑制剂和RNA干涉（RNA interference，RNAi）等方法表明，calcineurin-NFAT信号通路的激活对促发ES细胞和早期胚胎进行胚层分化是充分而且必需的。机制上，它和Erk1/2通路共同激活下游靶基因Src，进一步促进上皮-间充质细胞转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。而EMT很可能是ES细胞早期胚层分化必经的过程。

生物通：研究发现Calcineurin-NFAT信号通路存在于许多组织器官中，也与一些疾病相关，比如心肌肥厚，贵研究组的最新成果发现这一信号通路在胚胎干细胞及胚胎的早期谱系分化中的调控作用，这与这一通路的其它功能有何关联呢？

金老师研究组：Calcineurin-NFAT信号通路在调控胚胎干细胞及胚胎的早期谱系分化和心肌肥厚的作用机制上有一定的相似性。由于转录因子NFAT DNA结合能力较弱，通常和其他转录因子共同激活下游基因。其中ERK/MAPK信号通路下游的AP-1家族蛋白是最常见的共同激活因子。在心肌肥厚疾病模型中Calcineurin-NFAT和ERK/MAPK信号通路共同激活下游基因引起心肌肥厚。而在调控胚胎干细胞及胚胎的早期谱系分化的过程中Calcineurin-NFAT和ERK/MAPK信号通路同样协调作用。

生物通：这项研究除了发现关键调控信号通路，而且还确定了决定干细胞命运的关键调控因子Src，这一调控因子的具体作用是什么呢？

金老师研究组：基因Src是一个非受体络氨酸激酶。文献报道Src在调节细胞迁移延伸方面有重要作用。我们研究发现calcineurin-NFAT信号通路和Erk1/2通路共同激活下游靶基因Src促进ES细胞进行胚层分化。在ES细胞中过表达Src的活性形式可以快速诱导ES细胞发生分化，引起多能性标志基因显著降低，而分化标志基因，特别是滋养层和原始内胚层明显提高。而抑制基因Src活性可以完全阻断calcineurin-NFAT信号通路引起的细胞分化。机制上基因Src通过可以诱导上皮-间充质细胞转换（epithelial-mesenchymal transition，EMT）引起ES细胞发生分化。

生物通：在这项研究中，贵研究组主要采用了哪些实验技术呢，您认为其中的难点在哪里？

金老师研究组：我们主要运用了以下实验技术： 胚胎干细胞培养和分化（ES cell culture and differentiation）；基因芯片(micro-array)；实时定量PCR；染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)；荧光素酶报告基因实验(Luciferase Reporter Assay)；免疫印迹分析(Western blotting)；电泳迁移率变动实验(EMSA)；免疫荧光染色分析(Immunoflourescence staining)； 嵌合胚胎实验(chimeric embryo Assay) 等技术。

技术难度在于如何通过基因芯片和生物信息学寻找calcineurin-NFAT信号通路的下游基因。为了寻找Calcineurin-NFAT信号通路调节的下游基因，我们进行了NFAT信号通路抑制和激活情况下的生物芯片研究，发现168个基因受NFAT通路上调控，138个基因受NFAT通路下调控。我们将这些基因进行信号通路分析，发现焦点粘附和细胞骨架调节通路受NFAT调节最为显著。为寻找NFAT直接下游基因，我们将上述两个信号通路中的基因的启动子进行NFAT和其常见共同因子AP-1的结合位点预测。我们发现基因Src启动子区域含有保守的NFAT和AP-1结合位点，从而通过一系列实验证明Src的确是Calcineurin-NFAT信号通路在调控ES细胞分化过程中起作用的主要下游基因。

欲了解金颖研究组更多信息，请查看：
http://www.ihs.ac.cn/cPI.asp?id=29

原文摘要：
Calcineurin-NFAT Signaling Critically Regulates Early Lineage Specification in Mouse Embryonic Stem Cells and Embryos

Highlights
Calcineurin-NFAT signaling triggers lineage commitment in embryonic stem cells
Src is a key player downstream of the NFAT and Erk1/2 pathways
Src-mediated signaling promotes epithelial to mesenchymal transition
Calcineurin-NFAT signaling is required for early embryonic lineage development

Summary
Self-renewal and pluripotency are hallmarks of embryonic stem cells (ESCs). However, the signaling pathways that trigger their transition from self-renewal to differentiation remain elusive. Here, we report that calcineurin-NFAT signaling is both necessary and sufficient to switch ESCs from an undifferentiated state to lineage-specific cells and that the inhibition of this pathway can maintain long-term ESC self-renewal independent of leukemia inhibitory factor. Mechanistically, this pathway converges with the Erk1/2 pathway to regulate Src expression and promote the epithelial-mesenchymal transition (EMT), a process required for lineage specification in response to differentiation stimuli. Furthermore, calcineurin-NFAT signaling is activated when the earliest differentiation event occurs in mouse embryos, and its inhibition disrupts extraembryonic lineage development. Collectively, our results demonstrate that the NFAT and Erk1/2 cascades form a signaling switch for early lineage segregation in mouse ESCs and provide significant insights into the regulation of the balance between ESC self-renewal and early lineage specification.

作者简介：

金颖

学习经历
1978-1983 中国医科大学医学学士
1983-1988 北京协和医科大学/中国医学科学院基础医学研究所理学博士
1988-1994 美国北德克萨斯州大学医学中心博士后
1994-1999 美国德克萨斯大学西南医学中心博士后

工作简历
2000-至今 上海交通大学医学院基础医学院研究员、分子发育生物学研究室主任
2001-至今 健康科学研究所干细胞研究课题组组长
2006-至今 中国科学院干细胞生物学重点实验室主任

主要成果
1. 金颖研究组于2006年成功建立了第一株人的ES细胞系，并对所建立的人ES细胞的印迹基因表达进行研究（Human Molecular Genetics, 2006）。继续优化人ES细胞建系条件，又建立了多株人的ES细胞系。其中2株人ES细胞系参加了国际百株人ES细胞系的系统研究项目。还在无动物成分条件下，建立更加适合临床应用的人ES细胞系。此外，建立了多株正常受精胚胎和孤雌激活胚胎来源的小鼠ES细胞系，及大鼠ES细胞样细胞（Cell Research，2007；Cell Research，2009）。

2. 在探索优化建立诱导性多能干细胞技术体系方面取得了新进展。其中包括：（1）利用孕妇产前诊断的羊水细胞高效快速地建立了人诱导多能干细胞（Human Molecular Genetics，2009），（2）以人的成纤维细胞为滋养层，诱导小鼠神经祖细胞重新编程为iPS细胞（PloS ONE，2009）。

3. 该课题组集中对ES细胞自我更新调控中起重要作用的细胞核内转录因子，如Oct4，Sox2和Nanog，进行了研究。在国际上首先发现Oct-4蛋白质可以被泛素修饰，证明新发现的蛋白质Wwp2为Oct-4泛素化修饰的特异性泛素连接酶。接着，证明了WWP2介导OCT4 的泛素化修饰和启动OCT4的降解（Cell Research，2009）。Cell Research杂志对该研究结果进行了评述。此外，对Wwp2介导Oct4泛素化修饰的分子机制进行了详尽的研究（Cell Research，2009）。在对Wwp2的不断深入研究中，发现Wwp2还能调节RNA合成酶II大亚基（Molecular and Cellular Biology，2007）。另外，证明Oct-4蛋白质表达水平和转录活性受到翻译后SUMO-1的修饰（FASEB Journal，2007）。这些研究结果为阐明Oct-4表达水平的严密调控提出新的思路。揭示重要共激活因子p300及组蛋白的乙酰化修饰调控ES细胞关键转录因子Nanog的表达，并在ES细胞早期分化事件中的关键作用（The Journal of Biological Chemistry，2009）。在揭示维持ES细胞全能性的机制方面，证明在ES细胞分化过程中，核蛋白PARP1对Sox2的蛋白水平和FGF4转录的动态调控是必需的。该研究结果在The Journal of Biological Chemistry杂志发表后，被Cell Stem Cell等杂志的文章引用。此外，还在国际上首次提出了核蛋白在ES细胞自我更新和分化中扮演重要角色（Stem Cells，2009）。以上这些原创研究成果为揭示ES细胞自我更新的机制和指导ES细胞体外扩增做出了重要贡献。 2010年金颖研究组取得新的研究成果，分别在PNAS和Developmental Cells等国际高水平学术刊物上发表原创性研究论文。

（生物通：王蕾）