革命性的第三代测序系统——PacBio RS[新品推荐]

一、概述：

从1980年英国生物化学家Frederick Sanger与美国生物化学家Walter Gilbert建立DNA测序技术并获得诺贝尔化学奖至今已有近三十年了。在这三十年，DNA测序技术取得了令人瞩目的进展，为生命科学研究领域开辟了新的视角，使研究水平上升到新的高度。回顾过去，**代测序技术帮助人们完成了包括人类基因组计划在内的多种生物基因组序列测定及数据库的建立。第二代测序又以更高的通量，更简易，标准化，自动化的操作以及不断降低的测序费用加速拓展着测序应用的广度和深度，不仅大大促进了基因组学，转录组学，核酸蛋白相互作用等相关生物学研究的发展，还让人们看到了其在医学，临床诊断，药学等等领域广阔的应用前景，让人们对个人基因组时代充满期待。在这里，我们将给大家介绍*新的第三代测序技术及其将带来的革新。

Pacific Biosciences 公司研发的PACBIO RS 单分子实时测序系统，革命性地推出了单分子实时（Single Molecule Real Time, SMRT）DNA测序技术，在测序历史上首次实现了人类观测单个DNA聚合酶合成过程的梦想。使研究者**次能够利用单个 DNA 聚合酶对天然DNA 的合成进行大规模平行的、连续的实时观察。

一系列的文章也证明了PACBIO RS系统的核心技术——SMRT技术的原理和应用。Korlach与Turner于2009年2月在《科学》杂志上发表了一篇介绍PACBIO单分子DNA测序技术的文章。这篇文章代表了首个第三代测序技术的“原理验证”，因此引用率非常高。而后，他们又利用SMRT技术，直接测定了DNA的甲基化，这相对目前流行的第二代测序技术又前进了一大步。文章发表在2010年6月的《Nature Methods》上。

PACBIO RS系统的一个显著特点在于从样本制备到获得测序结果，所需的时间还不到一天，且典型的测序运行时间低至30分钟。序列数据在几分钟之内就能产生并能实时观察，这对于传染病监控和分子病理学尤为重要。目前的平均读长超过1000bp，其中5%*长的读长甚至可高达数千bp，比二代测序的读长要长很多。可为海量的二代测序数据拼接提供帮助。此外，试剂消耗和样本制备量极少，且不需要常规的PCR扩增步骤，使得假阳性率也大大减少，聚合酶动力学的直接观察也可赋予研究者以测序之外的更多应用。凭借这一系列的优势，Pacific Biosciences公司于2010年被美国麻省理工学院（MIT）的《技术评论》（Technology Review）杂志评为全球50家*具创新力的企业之一。

二、PACBIO RS系统测序原理

PACBIO RS系统**的 SMRT Cells，其含有数以万计纳米级的零模波导孔（zero-mode waveguides, ZMWs）。测序反应是在**的SMRT cell中进行的，每个SMRT cell中有150,000个ZMW。每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条DNA样品链。这样，SMRT Cell能够平行检测大约75,000个单分子测序反应。

当测序进行时，**的包被技术保证DNA 聚合酶和模板形成的复合体被锚定在 ZMW 的底部，反应溶液中带有标记着不同荧光磷酸基团的高浓度核苷酸可有效保证聚合酶合成的速度、精确性和持续合成的能力，检测装置则透过ZMW 底部的基层来实时观察 DNA 的合成过程：当 DNA 聚合酶检测到正确的核苷酸并将其插入模板时，这些碱基会在插入位置保留几十毫秒，而游离状态的碱基扩散的速度大约是几十微秒。在这个时间差中，检测器就可以检测到插入碱基的荧光信号，并将其转换成相对应的碱基类型。然后，DNA 聚合酶将碱基所带的标记着荧光集团的磷酸基团剪掉以形成天然DNA 链。此后，荧光信号迅速衰减至基线并开始下一轮的合成。PacBio RS使用一套优化的算法，将光学系统所捕获的信息翻译成对应的ACGT碱基信息。一旦测序开始，实时的数据就被传送到初步分析系统中，以实时生成碱基组成和质量值等信息。

三、PACBIO RS系统配置

PACBIO RS 系统内置的机械臂能够自动将SMRT Cell在储存区、准备区以及测序区之间进行转移，实现自动化的单个或批量测序实验。系统的RS Touch触摸屏实时显示系统反馈信息，如系统的运行状态，每个 SMRT Cell模板的制备过程，测序过程，碱基判定结果以及 QV 分值等，并实时播放测序过程中记录的影像信息。系统的RS Remote远程监控软件，允许客户远程设计和监控测序过程并进行初级数据分析。PACBIO RS 系统的测序分析软件包括SMRT Pipe、SMRT Portal和SMRT View三部分计算模块，可与用户的生物信息学平台实现无缝整合，轻松实现测序数据浏览、数据过滤和比对、诸如单核苷酸多态性（SNP）等稀有突变的可视化筛查等数据分析操作。系统还自带条形码阅读器，能够提供样品和试剂的信息，便于用户进行实验设计和数据管理。

四、PACBIO RS系统的测序方案

PACBIO RS 系统可提供多种SMRT测序方案，如标准测序、环形比对测序、频闪测序，每种方法都利用了长片段读取的优势并结合SMRT bell模板形式（模板处理后形成的一个类似哑铃的结构）和单DNA 聚合酶原理。

1）标准测序：从插入片段的一端测到另一端，只测一次。适合插入片段在 1-6Kb间。主要应用于再测序和重头测序。

2）环形比对测序：从插入片段的一端测到另一端后，由于模板是哑铃状结构的，因此，继续测序将得到互补链的序列信息，从而可通过对插入片段的反复测序来获得高准确度的单分子测序结果。适合插入片段在 250-500bp。主要用于发现和确定稀有变异。

3）频闪测序：由于激光连续照射会对 DNA聚合酶活性造成一定影响，因此，可以通过将激光器按照一定间隔打开和关闭，获得相对标准测序来说更长时间的聚合酶活性。这样可获得一系列分散的读取序列从而增加对超长插入片段的物理覆盖率。适合长度高达 10K的插入片段。主要用于结构变异的鉴定或者对复杂重复区域的拼接。

在每一种测序方案中，用户都可以调整参数，适合多种应用和项目类型。这种灵活性也提供了分多个步骤解决一个问题的能力。比如，使用者可以展开一个序列，使用频闪测序产生数千个碱基对的物理读长，然后用标准测序实现长读长的单分子结果读取，*终，使用环状测序进行多次测序实现前所未有的准确率并发现和确定稀有突变。另外，短的运行时间和灵活的耗材包装，提供了对各种规模的研究课题都经济有效的配套方案。

五、PACBIO RS系统的优势

相对于二代测序，突破性的三代测序有如下优势：

1）单分子实时检测，每条碱基链的数据都得到评估，更易发现稀有变异

2）*低DNA样品量仅500ng，无需PCR扩增，测序覆盖深度不受序列中 GC含量差异影响。可以对 100%A+T区域测序

3）除碱基序列信息外，可同时获得动力学信息，因此可对诸如 DNA甲基化之类的碱基变化情况直接进行分析

4）无与伦比的长序列读长

5）测序速度快，聚合酶反应速度（平均）> 1 base/sec，从样本制备到出结果，需时<1天

6）灵活性极强，有一系列数据管理和分析软件使二代三代测序流程实现无缝整合

7）测序流程简单

节选自《基因快讯》2011年第1期