单分子测序灵敏检测5-hmC[创新技巧]

【字体: 时间:2011年11月24日 来源:生物通

编辑推荐:

  对于“神秘”的5-hmC,目前还没有一种测序方法能准确判定它在基因组中的位置。为此,美国芝加哥大学与Pacific Biosciences公司的研究人员合作,利用第三代单分子SMRT测序技术和5-hmC的选择性化学标记方法来高通量检测5-hmC。通过聚合酶动力学带来的宝贵信息,研究人员可直接检测DNA甲基化,包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。

甲基化研究如今开展得如火如荼。除了人们熟知的5-mC,很多研究人员也将目光转向了另一种DNA修饰——5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)。5-hmC是5-mC的羟基化形式,1952年在噬菌体DNA中首次发现。几十年来,羟甲基胞嘧啶的研究一直围绕着它对于噬菌体DNA的保护作用。直到最近,人们发现它与多个关键的细胞功能有关,包括胚胎干细胞发育、正常的骨髓细胞生成和受精卵发育。

若想深入了解5-hmC的生物学功能,必须开发出一种灵敏的测序方法,以揭示它在基因组中的位置。而现有的测序方法,如亚硫酸氢盐测序,无法区分5-mC和5-hmC。为此,美国芝加哥大学与Pacific Biosciences公司的研究人员合作,利用第三代单分子测序技术和5-hmC的选择性化学标记方法来高通量检测5-hmC。该研究成果于11月20日发表在《Nature Methods》在线版上。

Pacific Biosciences公司开发的单分子实时(SMRT)DNA测序是一种第三代的测序技术,它利用单个DNA聚合酶分子来开展DNA合成,并监控核苷酸的不断掺入。核苷酸掺入的实时记录,不仅产生了序列读取,还带来了关于聚合酶动力学的宝贵信息。通过这些信息,研究人员能鉴别DNA碱基的修饰。

一般来说,聚合酶在修饰碱基周围的速率要比未修饰DNA慢。通过比较每个模板位点的掺入时间、脉冲间持续时间(IPD),可定量比较这一差异。利用这一方法,研究人员可直接检测DNA甲基化,包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。聚合酶动力学的测定是SMRT测序的内在组成,不会对DNA一级序列的测定有任何不良影响。

研究人员还对5-hmC进行了选择性化学标记。首先利用β-葡萄糖苷转移酶为5-hmC引入叠氮修饰,之后通过点击化学(click chemistry)反应安装一个生物素标签。通过这种方法,研究人员富集了基因组中的5-hmC,减少所需的测序量。此外,5-hmC上的大体积标签在SMRT测序中产生了更大的动力学信号,以便在较低覆盖度时更自信地指定修饰碱基。

为了检验这种方法的可行性,研究人员检测了小鼠胚胎干细胞(mESC)中的5-hmC。在选择性标记和富集之后,他们制备了SMRTbell DNA文库,用于鸟枪法SMRT测序,并分析动力学信号。他们检测到清晰的HS-N3-5-gmC信号。由于动力学信号的大幅增加,在单分子读取中可轻松指定5-hmC的位点,而无需与未修饰的对照样品进行比较。

作者认为,这种技术将是研究5-hmC生物学功能的有力方法。(生物通 余亮)

欢迎索取PacBio RS测序仪的更多资料!

原文摘要

Sensitive and specific single-molecule sequencing of 5-hydroxymethylcytosine

Nature Methods  (2011) doi:10.1038/nmeth.1779

We describe strand-specific, base-resolution detection of 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC) in genomic DNA with single-molecule sensitivity, combining a bioorthogonal, selective chemical labeling method of 5-hmC with single-molecule, real-time (SMRT) DNA sequencing. The chemical labeling not only allows affinity enrichment of 5-hmC–containing DNA fragments but also enhances the kinetic signal of 5-hmC during SMRT sequencing. We applied the approach to sequence 5-hmC in a genomic DNA sample with high confidence.

 

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 人才市场 | 新技术专栏 | 中国科学人 | 云展台 | BioHot | 云讲堂直播 | 会展中心 | 特价专栏 | 技术快讯 | 免费试用

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号