蛋白热稳定性的高通量分析[新品推荐]

Protein Thermal Shift 软件及试剂盒

Life Technologies最新推出了Protein Thermal Shift试剂及软件，它利用Applied Biosystems® 实时定量PCR仪来分析热稳定性，包括配体-蛋白结合的高通量筛选，促进蛋白稳定性的缓冲液条件的优化，以及突变或修饰对蛋白热稳定性的影响。这是一种简单且快速的方法，最快在0.5-2小时获得结果。

从现在开始，Applied Biosystems® 实时定量PCR系统又有了一个新用途，那就是分析蛋白的热稳定性，包括配体-蛋白结合的高通量筛选，促进蛋白稳定性的缓冲液条件的优化，以及突变或修饰对蛋白热稳定性的影响。这是因为，Life Technologies新推出了Protein Thermal Shift™（PTS）解决方案，它包括Protein Thermal Shift™ 试剂和软件。

蛋白是关键的分子，在药物开发的先导化合物发现过程中作为新药靶点进行研究。药物开发包括在多个不同分析中对数千个小分子和配体进行高通量筛选，这作为先导化合物发现项目的一部分，通常需要几个月的时间。蛋白靶点也是一个挑战，因为它们容易降解和聚集——需要加入无配体的蛋白稳定性筛选。除了药物开发，科研和工业中许多利用天然蛋白的其他研究项目也采用蛋白热稳定性筛选，这种筛选是利用蛋白熔解技术开展的。例如，在蛋白纯化、结晶和功能鉴定中鉴定并使用能最大程度稳定蛋白的配体和/或溶液（缓冲液）条件。

与现有技术相比，Protein thermal shift分析技术能够提高蛋白纯化和结晶的成功率，并降低药物开发的成本，提供了一种快速、经济高效且高通量的筛选方法。在我们实时定量PCR系统上运行的Protein Thermal Shift™ 应用让您能高效廉价地：

• 筛选样品的相对蛋白热稳定性
• 以高通量形式筛选配体与蛋白的结合
• 筛选能与您的蛋白靶点结合的小分子和片段文库候选药物
• 筛选能与您的蛋白靶点结合的抗体
• 在蛋白点突变后筛选样品的稳定性变化
• 系统鉴定适当/最佳的缓冲液条件，以测定蛋白与配体的相互作用
• 鉴定最佳缓冲液条件，以改善蛋白的纯化和分离
• 筛选缓冲液，以鉴定出成功的结晶条件
• 筛选缓冲液，以鉴定出蛋白的最佳储存条件

Protein Thermal Shift™ 技术如何起作用？

蛋白稳定性取决于蛋白的储存或反应缓冲液环境中的pH、盐含量及各种辅助因子的存在。实时熔解实验使用蛋白结合染料（如Protein Thermal Shift™ 染料），在Applied Biosystems® 任何实时定量PCR系统（包括StepOne™、StepOnePlus™、7500、7500 Fast和ViiA™ 7系统）上运行，产生目的蛋白在某一待测缓冲液环境中特异的荧光图像。pH、盐含量或待测缓冲液组分的变化反映为此荧光图像以及由此计算出的Tm（熔解温度）的相对变化。配体与蛋白的结合对蛋白的热稳定性也有着稳定作用，从而导致蛋白的荧光图像呈现出可测量的差异。

Protein Thermal Shift™ 分析

Protein Thermal Shift™ 试剂实现了蛋白熔解分析，这作为一个高效的筛选工具，可测定蛋白热稳定性，鉴定适当的缓冲液条件，并测定蛋白-配体的相互作用。这种Protein Thermal Shift™ 分析允许系统鉴定最佳的缓冲液条件以及能够稳定蛋白的配体。

Protein Thermal Shift™ 分析极易设置与运行，且整个流程一般需要0.5-2小时，这取决于所使用的系统和运行条件。我们实时定量PCR系统的可调节升降温速率和热准确性带来了充分的灵活性，可实现较短的运行时间，并顺应筛选流程的需求。

Protein Thermal Shift™ 分析中的步骤

• 将蛋白、缓冲液、配体（如果适用）与Protein Thermal Shift™ 染料混合
• 在Applied Biosystems® 实时定量PCR仪上运行熔解曲线实验
• 蛋白受热时解折叠
• Protein Thermal Shift™ 染料与暴露的疏水区域结合并发出荧光
• 将*.eds文件转移到Protein Thermal Shift™ 软件中进行分析
• 根据熔解曲线计算出熔解温度（Tm）
• Tm的变化与蛋白稳定性的变化或配体结合相关联

Protein Thermal Shift™ 软件

Protein Thermal Shift™ 软件可直接根据Applied Biosystems® 实时定量PCR仪器生成的文件来分析蛋白熔解的荧光读数。不同蛋白将有着不同的thermal shift图像，每一个都有独特的熔解曲线形状、斜率、信噪比和温度熔解范围。Protein Thermal Shift™ 软件根据以下两种方法，从这些曲线中生成一个或多个熔解温度（Tm值）：Boltzmann派生的Tm和衍生曲线确定的Tm。Boltzmann Tm值是取自荧光熔解曲线图的拐点（图1，上图），而衍生的Tm值是取自衍生曲线峰的顶部（图1，下图）。

Boltzmann方法将自动（或手动）鉴定的熔解区域内的数据拟合成两阶段的Boltzmann模型，以生成Tm。一般来说，对于有着单个熔解区域的蛋白，可使用Boltzmann方法。然而，对于有着多个熔解区域的蛋白而言，可利用衍生方法来确定每个样品的最多六个Tm值。衍生方法利用原始数据的二阶导数来预测温度，其中衍生图中可能存在最多六个峰（局部极大值）。信噪比的经验衍生阈值可用来确定哪个局部极大值被检测到。

案例研究：蛋白-配体结合

蛋白研究人员使用多种方法来研究蛋白稳定性及筛选配体，包括生物传感器及其他高通量筛选（HTS）方法，以及较低通量的量热仪和圆二色谱系统。这些方法能够生成蛋白的大量细节，但要么太慢，需要大量蛋白样品（量热仪和圆二色谱），要么快但很贵（生物传感器）。Protein Thermal Shift™ 技术以高通量形式满足了快速廉价的样品筛选需求，能够迅速缩小候选物的数量，以便用其他技术进行更详细的研究。Protein Thermal Shift™ 解决方案的灵活性、速度和易用性让它成为那些需要了解蛋白稳定性在整个研究阶段如何受影响的蛋白研究人员的极佳选择。

图1展示了蛋白结合配体的鉴定，如图所示，与配体结合时，蛋白的Tm增加。红色曲线代表了蛋白溶液的重复测定，而蓝色曲线代表了同一蛋白在与配体共同孵育后的重复测定。对于此样品，Tm从~41.5ºC变化至47.5ºC，表明蛋白稳定性随配体结合而增加。

图1. 蛋白与配体结合后的稳定性。在加入配体后，蛋白Tm增加。（上图）荧光熔解曲线图。（下图）衍生曲线图。

小结

蛋白研究人员使用多种方法来研究蛋白稳定性及筛选配体。这些方法通常很慢，操作繁琐，且需要大量的蛋白样品。一些快速的方法虽存在，但是与Protein Thermal Shift™ 相比，运行起来非常昂贵。

在Applied Biosystems® 实时定量PCR系统上利用Protein Thermal Shift™ 试剂盒可以高通量形式实现样品的廉价筛选，以便在多个受蛋白稳定性影响的应用中迅速缩小候选配体或缓冲液条件的数量。

Protein Thermal Shift™ 软件让研究人员能快速比较不同分析条件或不同配体添加后Tm的变化（相对参考样品），从而提供了一个工具，来筛选并鉴定能稳定（去稳定）蛋白的条件，或筛选能与目的蛋白结合的配体。