NimbleGen叠式探针设计芯片用于RNA CaptureSeq技术进行转录子信息深度挖掘[创新技巧]

最近《Nature》杂志上发布了一个称为RNA CaptureSeq的技术， 它结合了RNA序列捕获以及饱和测序方法（sequencing-to-saturation），用于深度挖掘转录组信息。该技术的最大特点是深度的提高。实验中使用了NimbleGen定制型的基因芯片，叠式覆盖的探针针对目标区域的转录子序列设计，同时包括基因组中可能出现的未知可变剪切的位点。

最近《Nature》杂志上发布了一个称为RNA CaptureSeq的技术¹， 它结合了RNA序列捕获以及饱和测序方法（sequencing-to-saturation），用于深度挖掘转录组信息。该技术的最大特点是深度的提高。

实验中使用了NimbleGen定制型的基因芯片，叠式覆盖的探针针对目标区域的转录子序列设计，同时包括基因组中可能出现的未知可变剪切的位点。实验中，RNA反转录后，与NimbleGen DNA芯片杂交，然后通过测序尽可能多地获得目标区域的转录子序列，高深度的测序结果能够发现普通RNA测序无法发现的蛋白质编码序列的异构体及长非编码RNA（lncRNAs）。

此次实验富集前胎足成纤维细胞转录组中的近2300个区域，最终的测序结果相比普通的RNA测序，得到在目标区域内近400倍的测序数据。实验发现的新的转录子，包括一些已经被广泛研究的基因如P53和HOX基因。此外，还确定了一系列长非编码RNA和数百个罕见的对应基因间序列的转录子。

虽然RNA CaptureSeq方法不能提供转录组的全貌，但提供了特定区域详细的编码和非编码转录子信息。通过深度测序结果，即使转录水平很低或者只是在细胞亚群中出现的转录子也能鉴定。这种定向的方法，可以得到普通转录组测序不能得到的覆盖深度。对于只对特定区域的序列感兴趣的研究人员就可以通过这个方法，低成本高效益的获取相关信息。

在此次研究中，研究人员使用定制的是NimbleGen Titanium Optimized Sequence Capture序列捕获385K芯片，捕获2265个基因区域的77万RNA碱基序列，这些区域包含大约50个已知的蛋白编码基因和lncRNAs。此外还包括了知之甚少的基因间区段，这些区段与核小体修饰有关，影响到基因的转录。只有利用NimbleGen Sequence Capture芯片的叠式覆盖探针设计，才能在相同区段覆盖多条探针，从而确定核小体包装的特征，而核小体的不同包装会影响表达水平。

在进行序列捕获之后，研究人员使用了一短读长测序平台和罗氏454长读长测序两种二代测序平台进行测序。短读长测序平台的数据提供了转录子的各种亚型，长度长的罗氏454平台提供了详细的剪接位点、遗传变异及基因编辑(gene editing)信息。研究人员首先将两个平台独立数据分别于进行序列比对，再组合两者的信息进行对比，获得了人类胎儿脚成纤维细胞(human fetal foot fibroblasts)目标区域的转录子多样性以及剪接模式。

RNA捕获富集前的样本中有48091多个转录子序列，其中落在目标区域内的序列比例非常低。普通的RNA测序结果中， 2040万个测序序列中只有0.21％的序列对准目标区域，而进行的捕获富集后测序实验产生的2580万pair-end序列中超过80％落在目标区域内，相当于平均测序深度提高了4607倍。有近四分之一的转录子未曾通过普通RNA测序技术发现，而另外10％的转录子在普通RNA测序中最多只获得过一个序列读数。

使用罗氏454的GS FLX Titanium平台，大约获得31万条序列。长读长数据帮助验证了近65％的短读长平台测序获得的转录子序列，并且确认了新的、罕见的转录子剪切位点，其中一些位于实验设计中覆盖的基因间隙序列。

数百个新发现的在基因间隙剪切或连接的转录子，大多未曾在普通的RNA测序实验数据中获得，可能因为他们表达水平很低或者只是存在于一部分细胞亚群中。这些结果表明各发育阶段的细胞和不同组织的细胞，转录差异之大可能超过从前的估计。

通过定制不同的NimbleGen芯片，RNA CaptureSeq的实验技术还可以应用到其他领域他，如括宿主 - 病原体相互作用，不同物种鉴别，GWAS研究后定向区段的研究，癌症相关区域转录子深度测序等。RNA CaptureSeq方法将帮助研究人员聚焦转录组中的目标区域，通过在较低成本下提高测序深度，更全面了解特定区域转录子的全面信息。

1. Mercer, T. R., Gerhardt, D. J., Dinger, M. E., Crawford, J., Trapnell, C., Jeddeloh, J. A., Mattick, J. S., & Rinn, J. (2011). Targeted RNA sequencing reveals the deep complexity of the human transcriptome. Nat Biotech, 1546-1696. doi:10.1038/nbt.2024