高通量芯片技术在细胞遗传学检测领域的划时代飞跃[创新技巧]

【字体: 时间:2011年12月19日 来源:基因有限公司

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  细胞遗传学是从细胞的角度,主要是从染色体的结构和行为来研究遗传现象,并找出遗传机制和遗传规律。目前和基础理论与临床医学紧密结合对于遗传咨询和产前诊断具有重要意义。而迅速发展的芯片技术在检测通量、分辨率、灵敏度等方面都远远超过了传统的细胞遗传学方法。因此可以说高通量芯片技术是细胞遗传学检测领域的一个跨时代的飞跃。

细胞遗传学是从细胞的角度,主要是从染色体的结构和行为来研究遗传现象,并找出遗传机制和遗传规律。目前和基础理论与临床医学紧密结合对于遗传咨询和产前诊断具有重要意义。而迅速发展的芯片技术在检测通量、分辨率、灵敏度等方面都远远超过了传统的细胞遗传学方法。因此可以说高通量芯片技术是细胞遗传学检测领域的一个跨时代的飞跃。

一、细胞遗传学研究方法进展

细胞遗传学是遗传学与细胞学相结合的一个遗传学分支学科。研究对象主要是真核生物,特别是包括人类在内的高等动植物。此后又衍生出一些分支学科,研究内容进一步扩大。它把遗传学研究和细胞学方法结合起来。从细胞的角度,主要是从染色体的结构和行为来研究遗传现象、找出遗传机制和遗传规律。目前细胞遗传学的基础理论与临床医学紧密结合的新兴边缘科学,研究染色体畸变与遗传病的关系等,对于遗传咨询和产前诊断具有重要意义。目前主要的研究方法有以下几种。

1. 核型分析  

将待测的细胞的染色体按照该生物固有的染色体形态特征和规定,进行配对、编号和分组,并进行形态分析的过程。染色体核型分析可以从宏观上分析患者其它可见的染色体异常情况。对那些毛毛虫样的染色体图像的分析是技术性非常强、并且非常耗费人力的工作。因此大多报告仅对20个细胞的染色体核型进行分析,一般最多分析的细胞数不超过50个。大片段的染色体缺失和扩增可以通过核型分析判断,略微细微的染色体片段的变化是无法通过核型分析检查的。因此直观是核型分析的优势,但是分辨率较低则是核型分析的无法逾越的缺点。

2. FISH  

FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的,二者经变性-退火-复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。FISH可以定位基因组中多个同源位点,结果直观、可靠。但是FISH法检测步骤繁杂,尤其受探针大小的影响较大,2kb以下的cDNA序列很难定位,而且结果需要有经验的细胞遗传学家进行分析。为了检测的结果更易于观察,使用探针种类较少。因此每次只可以使用少数几个有针对性的探针用以检测有限个数的DNA变异区域。并且无法发现未知的染色体变异区域。

3. CGH  

比较基因组杂交(comparative genomic in situ, CGH)是FISH技术的一大延伸与重大飞跃,是1992年后发展起来的一种分子细胞遗传学技术。它通过单一的一次杂交,可对某一肿瘤整个基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查。其基本原理是用不同的荧光染料通过缺口平移法分别标记肿瘤组织和正常细胞或组织的DNA制成探针,并与正常人的间期染色体进行共杂交,以在染色体上显示的肿瘤与正常对照的荧光强度的不同来反映整个肿瘤基因组DNA表达状况的变化,再借助于图像分析技术可对染色体拷贝数量的变化进行定量研究。CGH技术所需DNA样本量少,对样本要求低。但是CGH技术所能检测到的最小的DNA扩增或丢失是在3-5Mb,故对于低水平的DNA扩增和小片段的丢失会漏检。对杂合性缺失等现象无法检测。

4 染色体显微切割  

用显微操纵器切割某条染色体特定区域的技术。所得到的染色体特定区带可用于该区带DNA或基因的克隆。该技术自80年代初问世以来,通过与PCR、微克隆、FISH、DNA测序、文库筛选、比较基因组杂交等分子生物学技术相结合,在染色病研究与诊断、文库构建、基因定位与克隆、以及进化遗传学与肿瘤遗传学等方面的研究中取得了令人瞩目的成绩,并以其独特的直接性和实用性保持其分子生物学领域良好的应用前景。该技术可以在宏观可操作范围内,作为其他技术的补充发挥重要的作用。

传统的细胞遗传学研究方法瓶颈在于通量、分辨率和准确性等问题,而芯片技术打开了一片新天地。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上,所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析,从而解决了传统技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且,通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值,如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。把芯片技术应用于细胞遗传学势必对该领域研究方法带来深远的影响。

二、Affymetrix细胞遗传学芯片

1.SNP6.0芯片

在使用芯片研究细胞遗传学这一领域中,Affymetrix旗舰产品SNP6.0芯片创造了辉煌的历史。在一张芯片上可以分析一个样本906,600个SNP(Single Nucleotide Polymorphisms) 的基因型,该芯片同时含946,000个CNV(copy number variation)探针,SNP和CNV两种探针高密度且均匀地分布在整个基因组,作为拷贝数变异和杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)检测的工具来发现微小的染色体增加和缺失,除了传统的核型分析,SNP Array 6.0分辨率远远超出业内其他aCGH或SNP芯片。按照经典的遗传统计计算,SNP6.0产品的覆盖度已经足以满足目前各人种遗传疾病研究对genetic power的要求。SNP6.0上所具有的检测1,800,000个生物标记的能力,使之成为同时检测常见和稀有变异全基因组关联分析的最有力的武器。在Affymetrix的产品研发中,每一条CNV探针的设计都经过了计量效应考证,即以特别细胞系做为模型,保证每一条探针的杂交信号值与真实情况的拷贝数成正比。这保证了数据结果的可靠和准确。

目前广大的科研工作者使用SNP6.0芯片用于细胞遗传学研究,并取得了丰硕的成果。Nik-Zainal S等[1]利用Affymetrix SNP6.0芯片研究了女性因生殖系统先天畸形而患有不孕症的发病机理。研究表明,染色体(16p11.2)具有微缺失的现象是导致发病的重要原因之一,为医学诊断提供了直接的依据。研究干细胞分化的机理是医学研究发展的一个重要方向,并具有巨大的理论和市场价值。Hussein SM等[2]利用Affymetrix SNP6.0芯片比较了纤维原细胞及胚胎肝细胞和其多功能细胞的拷贝数变化的情况。实验表明,不同的细胞状态,拷贝数变异具有特异性,为发育生物学提供了新的科研思路。同卵双生的双胞胎从生物学上认为是完全一样,但个性迥然不同必然有其合理的原因。Maiti S等[3]采用Affymetrix SNP6.0芯片对这一现象做了理论上的研究。研究结果说明,双胞胎个体在发育生长的过程中,染色体中产生新的拷贝数变异是造成个体差异的一个重要原因。该原因导致其中一个个体精神状态正常,而另个则患有精神分裂症。诸如此类的科研成果还有很多很多,这些研究结果都为医学临床诊断提供了非常好的理论支持。

2.Cytoscan HD芯片

基于严谨的科学理念和对芯片质量的不断追求,Affymetrix于2011年的夏天,又推出了新型的重点于染色体变异情况研究的新一代细胞遗传学芯片——Cytoscan HD芯片。这势必成为细胞遗传学的又一有力工具。该芯片的特点可以总结如下:

A. 目前市面上基因覆盖率最高的芯片

Cytoscan HD芯片具有160万个拷贝数探针组,用于检测染色体拷贝数的变异。是目前市面上密度最高,覆盖范围最广,检测效率最高的细胞遗传学芯片产品。同时该芯片具有90万个SNP探针组,可以用于检测UPD等杂合性缺失的遗传现象。

B. 优化的试剂盒和操作流程

Affymetrix的专家们不仅设计和生产了Cytoscan HD芯片,而且优化了试剂和操作流程,使科研工作者更易操作,更少失误,并节省时间和金钱。规范的实验室要求和流程化的操作流程,使得到的结果具有非常好的一致性。优化的试剂盒包括几乎所有的试剂,使得科研工作者准备更方便。整个操作流程仅需要不到3天的时间。

C. 优异的性能

针对大于400Kb的拷贝数变异的片段和特异SNP的鉴定,Cytoscan HD的灵敏度和特异检出率均超过99%,远远超过美国医学基因学院推荐的阈值。

D. 可以在基因水平上检测杂合状态

Cytoscan HD芯片可以检测包含在基因表达区域的75万个SNP,因此可以检测杂合性缺失(LOH),双亲二倍体(UPD)等现象。

E. 简单易用的软件

为细胞遗传学研究工作者,量身定做了分析软件——Chromosome Analysis Suite (ChAS)。不仅免费,而且简单易用。

目前该款芯片已经为广大科研用户所使用,基于Affymetrix每款芯片的成功使用,完全有理由相信,该款芯片势必在细胞遗传学的科学研究中发挥极其重要的作用。

三、芯片优势小结

1.通量高  

芯片最直接的优点就是通量高。Affymetrix专利的原位光蚀刻技术使其可以生产目前世界上密度最高的芯片。这样一次实验可以获得最大通量的数据结果。如Cytoscan HD芯片具有可以检测目前已知基因组几乎所有拷贝数变异的探针。

2.操作流程化和标准化  

为了芯片上每个探针得到最真实可靠的信号,Affymetrix在研发芯片本身的同时,还发开了标准化的实验流程,使得科研工作者更容易使用芯片,拿到可靠的数据。

3.数据准确性高 

数据的准确性首先在于探针设计的合理性。Affymetrix在考虑探针特异性的同时,还对探针进行了量化的筛选,保证了探针信号强弱和染色体片段拷贝数多少的一致性。

4.检测分辨率高  

针对整个基因组,大约1000个碱基,Affymetrix的专家们就会设计一个探针用于检测拷贝数变异或者SNP位点。如此高密度的探针保证了高分辨率的检测。

5.可检测特殊拷贝数变异  

在Affymetrix的细胞遗传学芯片中,不仅具有CNV探针,并且具有大量的SNP探针。使用两种探针,不仅可以检测染色体拷贝数的变异情况,而且,对某些特殊的染色体变异也可以进行有效的检测,如杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)和单亲二体(uniparental disomy,UPD)。具有其他公司产品无可比拟的优势。

6.配套软件简单  

在大多数细胞遗传学的科研工作者中,临床医生占有很大的比例。因此Affymetrix在研发芯片优化实验流程的同时,也开发了简单易用的分析软件。如分析SNP6.0芯片的Genotyiping Console,分析Cytoscan HD芯片的Chromosome Analysis Suite等。软件界面有好,操作流程简单,使得科研工作者更容易得到关心的结果。

免费索取:Affymetrix细胞遗传学芯片的更多资料

四、展望

生物科学正迅速地演变为一门信息科学。利用DNA芯片可以快速高效地获取空前规模的生命信息,这一特征将使DNA芯片技术成为今后科学探索和医学诊断等诸多方面的革命性的新方法、新工具。在细胞遗传学这一研究领域中,基因芯片在通量、分辨率、检测灵敏可靠等方面,大大超过了传统研究方法,可以说高通量芯片技术是细胞遗传学检测领域应用的划时代飞跃。

参考文献:

[1] Nik-Zainal S, et al. High incidence of recurrent copy number variants in patients with isolated and syndromic Müllerian aplasia.J Med Genet. 2011 Mar;48(3):197-204. Epub 2011 Jan 28.

[2] Hussein SM, et al.Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency.Nature. 2011 Mar 3;471(7336):58-62.

[3] Maiti S, et al. Ontogenetic de novo copy number variations (CNVs) as a source of genetic individuality: studies on two families with MZD twins for schizophrenia.PLoS One. 2011 Mar 2;6(3):e17125.

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