石蜡包埋（FFPE）样品的microRNA表达谱揭示重要生理功能[创新技巧]

长期以来，医疗和科研机构一直采用福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）方法保存病理组织。这些FFPE样本十分珍贵，因为每个样本都包含大量的病人数据和病史信息。多项研究证实，FFPE处理对microRNA的影响极小，从FFPE样品中提取的microRNA仍可以提供可靠的表达水平。以下为LC Sciences（联川生物）客户利用微阵列芯片研究FFPE样品中microRNA表达谱的部分成功案例。

肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是最常见的一种成人肾脏肿瘤。转移性肾细胞癌非常难以治疗，它的5年生存率≤10%。目前，研究发现microRNA与癌症转移相关并且有望成为预后生物标志物。来自加拿大的NMA White等人[1]采用28例新鲜冰冻组织和80例FFPE组织（包括原发性和转移性），利用miRNA微阵列（LC Sciences）对比了转移性肾细胞癌和原发性肾细胞癌的miRNA特征信号，并用实时定量PCR验证了实验结果。与原发性肾细胞癌相比，转移性肾细胞癌中有65个miRNA有显著变化。通过检验2组病人的miR-10b、miR-126、miR-196a、miR-204和miR-215的表达水平，验证了微阵列实验结果。结果显示miR-215的过表达降低了肾细胞癌细胞系模型中的细胞迁移和侵袭。另外，通过基因表达谱分析，他们鉴定了miR-215的直接和间接靶标会造成肿瘤转移。结果发现，miRNA表达在转移性肾细胞癌中有所变化，并通过不同的生物学过程造成癌症转移。表达异常的miRNAs具有作为预后生物标志物以及治疗应用的前景。

来自美国埃莫里大学Winship肿瘤研究院（Winship Cancer Institute of Emory University）的Yun Zhu等人[2]对从石蜡包埋组织中提取的total RNA进行了微阵列分析（LC Sciences）和qRT-PCR实验，目的是探索miRNA是否与电离辐射（尤其是高LET电离辐射）促进肝脏癌变有关。电离辐射（IR）会促进癌变，高线性能量转移（LET）电离辐射比低-LET电离辐射更具癌变风险，然而它的发生机理尚未清楚。miRNA通过转录后修饰作用对癌变具有重要作用。微阵列结果显示，在数百个miRNA中，只有miR-21在高LET电离辐射促小鼠肝脏肿瘤中的表达水平比未照射肝脏组织高出6倍。作者还发现，人或小鼠肝细胞在经过电离辐射暴露后，miR-21表达上调，在来自全身辐照小鼠的肝脏组织中也得到了相同的结果。miR-21在高LET辐照细胞或肝脏组织中的上调更为显著。在未受照后，低LET或高LET辐照人肝细胞中miR-21过表达，这些细胞在裸鼠中具有致瘤性。高LET辐照细胞中的肿瘤最大，同时miR-21-靶标：PTEN和RECK的变化也最显著。此外，电离辐射诱导miR-21上调取决于AP-1（时间较早，2h之内）的上调/活化和ErbB/Stat3通路（时间较晚，超过2h），同时也取决于电离辐射剂量。综合上述结果，作者得出了电离辐射诱导miR-21上调在电离辐射（尤其是高LET电离辐射）促进肝脏肿瘤发生中起着重要作用的结论。

为了了解microRNA（miRNA）调控乳腺癌的发生机理，美国克瑞屯大学骨质疏松学研究中心（Osteoporosis Research Center, Creighton University Medical Center）的科学家[3]利用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）乳腺组织进行了miRNA表达谱微阵列（LC Sciences）筛选，其中包括良性13例，乳腺导管原位癌（DCIS）16例，浸润性导管癌（IDC）15例。结果发现25个miRNA具有差异表达（P < 0.01），其中人乳腺癌组织DCIS期和IDC期的l et-7家族miRNA与比良性阶段相比表达下调。作者进一步发现FFPE样品中的ER-α表达与数个let-7家族成员之间呈负相关。之后的生物信息学分析显示，ler-7 miRNA序列与雌激素受体alpha（ER-α）的3’非编码区（3'-UTR）的序列匹配，说明ER-α可能是let-7的靶标，这一推论通过荧光素酶检测、蛋白质表达和mRNA表达等分析得到了验证。let-7 miRNA在ER-阳性乳腺癌MCF7细胞系中的过表达会造成ER-α活性下降。let-7 miRNA阻断ER-α信号通路，抑制了细胞增殖，随后引发了MCF7细胞中的细胞凋亡过程。这一发现揭示了let-7 miRNA调控乳腺癌ER-α介导细胞恶性生长的一种新机制。

儿童肝癌比较罕见，仅占恶性肿瘤的1.1%，年发病率为1.5人/百万。肝母细胞瘤和肝细胞癌是15岁或以下年轻人中最为常见的恶性肿瘤。两种肿瘤的分子机理仍不清楚，常用的标志物（如CTNNB1、APC、IGF-2）并不一定能鉴定偶发病例，而microRNA与肿瘤发生过程密切相关。来自意大利的科学家[4]利用微阵列（LC Sciences）和定量反转录PCR实验测定了肝母细胞瘤中的microRNA表达谱。利用测序分析CTNNB1和APC，并利用甲基化特异性PCR评估IGF- 2启动子的甲基化状态。虽然在样本中检测到了少量基因变异，但是在肝母细胞瘤发现了某些microRNA的表达水平变化。非监督聚类分析显示microRNA表达谱可以区分肿瘤组织和非肿瘤组织。对microRNA组成做进一步分析，发现肝母细胞瘤与肝细胞癌相比有4个上调microRNA（miR-214，miR-199a，miR-150 [P < .01]，miR-125a [P < .05]）和1个下调microRNA（miR-148a [P < .01]）。尽管作者的样品从遗传学角度看尚不够充分，但仍呈现了相较于非肿瘤组织和肝细胞癌而言十分独特的microRNA表达模式。mircoRNA或许可以作为小儿肝脏肿瘤分类的有效标志物。

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关于LC Sciences与联川生物
LC Sciences（美国）是一家专业提供基因组及蛋白质组产品与服务的生物技术公司，提供下一代测序技术服务，全方位的DNA，RNA及多肽微阵列服务，可用于核酸/蛋白表达谱与功能分析，生物标记发现和新药筛选，研发应用于诊断和生物传感的微型实验设备。基于专利的µParaflo®微流体技术，LC Sciences可提供具有高度灵活性和定制化的创新产品来满足客户快速变化的需求。联川生物作为LC Sciences在中国成立的全资子公司，随时为您提供最新的生物技术服务和前沿信息。

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1. White NM, Khella HW, Grigull J, Adzovic S, Youssef YM, Honey RJ, Stewart R, Pace KT, Bjarnason GA, Jewett MA, Evans AJ, Gabril M, Yousef GM. (2011) miRNA profiling in metastatic renal cell carcinoma reveals a tumour-suppressor effect for miR-215. Br J Cancer 105(11), 1741-49. [abstract]
2. Zhu Y, Yu X, Fu H, Wang H, Wang P, Zheng X, Wang Y. (2010) MicroRNA-21 is involved in ionizing radiation-promoted liver carcinogenesis. Int J Clin Exp Med 3(3), 211-22. [abstract]
3. Zhao Y, Deng C, Wang J, Xiao J, Gatalica Z, Recker RR, Xiao GG. (2010) Let-7 family miRNAs regulate estrogen receptor alpha signaling in estrogen receptor positive breast cancer. Breast Cancer Res Treat 127(1), 69-80. [abstract]
4. Magrelli A, Azzalin G, Salvatore M, Viganotti M, Tosto F, Colombo T, Devito R, Di Masi A, Antoccia A, Lorenzetti S, Maranghi F, Mantovani A, Tanzarella C, Macino G, Taruscio D. (2009) Altered microRNA Expression Patterns in Hepatoblastoma Patients. Transl Oncol 2(3), 157-63. [abstract]