适用于MiSeq系统的Nextera样品制备[新品推荐]

简介

对于重测序和小基因组的de novo装配而言，新一代测序正日渐成为一种重要的工具。在MiSeq系统简化的测序流程中，Nextera样品制备是不可缺少的一部分。有了Nextera，即用的文库可在90分钟内制备好，而手工操作时间仅为15分钟，这样使用MiSeq系统的研究人员可在8小时内从50 ng DNA样品中获得分析好的数据。本应用指南说明了独特的转座体（transposome）介导的片段化和接头连接如何实现快速高效的样品制备，以便在MiSeq系统上进行快速的短读取测序，以及Nextera样品制备如何支持最高质量的序列，以利用更长的末端配对读取进行de novo装配。

结果

我们从了解透彻的大肠杆菌MG1655菌株中分离出基因组DNA，并利用Illumina的Nextera DNA Sample Preparation Kit在90分钟内制备一个测序文库。对于MiSeq仪器上的测序，制备好的样品可放置在试剂槽中，并连同流动槽一起上样到仪器内。所有后续步骤在仪器上开展，包括簇生成、单端或末端配对测序以及初步的数据分析。

对于重测序，MiSeq集成的计算机自动开展数据分析，而无需特殊的服务器或计算设备。Nextera制备的1×35 bp运行的主要运行指标如表1所示，此运行在8小时内完成。Nextera样品制备产生了簇密度高、质量评分优异且基因组覆盖度高的序列数据。

表1：主要重测序指标1×35 bp

指标	MiSeq系统
总时间*	8小时
通过过滤的读取（百万）	5.82
> Q30的碱基百分比（99.9%准确率）	94.5
平均覆盖深度	41×
基因组覆盖度百分比	97.89
缺口数	345
缺口平均大小	296
总的缺口（Kb）	102
总的SNP	32

对于de novo测序，我们在MiSeq上对Nextera样品制备试剂所制备的大肠杆菌文库进行了测序，读长为2×150 bp。同时，为了比较，我们还在MiSeq上对TruSeq™样品制备试剂所制备的大肠杆菌MG1655菌株进行了测序，读长为2×150 bp。利用Velvet v1.1.05开展基因组装配。Nextera和TruSeq试剂所制备样品的de novo装配结果如表2所示。两种样品制备方法都带来了出色的de novo装配结果。

表2：De Novo装配指标2×150 bp

指标	Nextera样品制备	TruSeq样品制备
装配大小（Kb）	4.57	4.57
最大Contig（Kb）	314	312
N50（Kb（Contigs））	175（11）	149（11）
平均Contig（Kb）	38.0	36.6
Contig数量	120	125
基因组覆盖度百分比	99.96	99.93

取决于某一测序应用所需的基因组覆盖度，MiSeq序列读长可微调，以带来速度和质量的适当组合。表3显示了不同读长时大肠杆菌MG1655的MiSeq序列产量。正如预期，随着读长增加，并使用末端配对读取，平均的覆盖深度增加，而缺口减少。MiSeq上最长的末端配对读长（2×150 bp）带来了99.83%的最高基因组覆盖度。

表3：各种读长的主要测序指标

指标	2×150 bp	2×50 bp	2×35 bp	1×35 bp
基因组覆盖度	99.83	99.70	99.61	97.89
平均覆盖深度	356	117	81	41
缺口数	55	121	259	345
缺口平均大小	373	258	161	296
总的缺口（Kb）	20.5	31.1	41.6	102.1

结论

细菌基因组DNA样品可利用Nextera制备，在MiSeq系统上测序，并在8小时工作日内完成分析。短读取足以获得高质量的小基因组装配，随着读长增加，并使用末端配对读取，质量可逐步改善。Nextera提供了充分的灵活性，可调整读长，选择单端或末端配对读取，这取决于实验的时间和质量要求。对于所有小基因组测序项目，Nextera和MiSeq可在最快的时间内提供最高质量的序列。

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