HRM分析的注意事项及如何优化[心得点评]

HRM分析是一门新兴的技术，仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，省时省力，因此相当受欢迎。在开展HRM分析之前，许多新手都希望了解分析过程的注意事项，以及如何优化。对于此，Bio-Rad的专家给出了一些指导意见。生物通编辑将这些编译出来，以飨读者。

生物通编者按 随着越来越多带HRM分析功能的定量PCR仪的上市，高分辨率熔解（HRM）这种方法正在迅速普及。HRM分析是一门新兴的技术，仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，省时省力，因此相当受欢迎。生物通之前也写过一篇文章，介绍HRM的应用前景（详见http://www.ebiotrade.com/newsf/2010-2/2010223151611573.htm）。

在开展HRM分析之前，许多新手都希望了解分析过程的注意事项，以及如何优化。对于此，Bio-Rad的专家给出了一些指导意见。生物通编辑将这些编译出来，以飨读者；同时，我们也要感谢Bio-Rad提供的资料。

简介

在基因组学研究中，区分并了解群体及个体之间的遗传变异是一个重要的目标。许多常见的疾病（如糖尿病、癌症、骨质疏松等）和临床上相关的表型性状是由多个基因产物与环境因素之间的复杂相互作用引起的。高分辨率熔解（HRM）分析是对PCR扩增后的DNA片段的熔解曲线进行定量分析，被认为是熔解分析的新一代应用。

这是一项低成本、容易实现的技术，仅需要一台实时定量PCR检测系统，不过这台仪器必须有卓越的热稳定性和灵敏度，且带有HRM专用的软件。当然，要想获得重复可靠的结果，还离不开小心的样品制备和周密的实验设计。在开发HRM分析时，须注意以下方面。

样品选择和质量控制

带有HRM分析的qPCR是一项可靠的技术，对大部分分析而言，良好的样品制备将产生稳定、可量化的数据。为了确保优质的数据，您必须：

• 只使用A260/280和A260/230比例分别在1.8-2.2和1.6-2.4范围内的样品
• 通过凝胶电泳检查DNA的完整性，以取保未降解、高分子量DNA片段的存在
• 采用适当的参考基因作为内部扩增对照，并将不同样品之间的浓度差异归一化
• 尽量减少DNA溶液中的EDTA浓度，因为EDTA可能干扰下游反应中一些酶的活性

HRM兼容的饱和染料

HRM分析依靠的是分析熔解动力学中细微变化的能力，它通常需要一种饱和染料（图1）。这些染料对PCR的抑制比SYBR Green I染料要低，因此可使用更高的浓度，以便一致地区分PCR扩增的DNA。目前有多种染料可供选择，最常用的是EvaGreen®、LCGreen、SYBR® GreenER™和SYTO 9 染料。Bio-Rad的Precision melt supermix是一种即用型的实时定量PCR试剂，专为EvaGreen而优化，适用于任一台具有HRM功能的实时定量PCR系统。

图1. 饱和染料和非饱和染料。A. 在使用不饱和染料如SYBR Green I时，DNA熔解过程中染料分子会跑到未熔解的区域，导致熔解曲线的温度变化很小或不均一。B. 在使用饱和染料时，熔解区域的染料分子不能跑到未熔解部分，生成能准确反映DNA序列的熔解图像。

引物设计和扩增子长度

分析短的DNA扩增子能协助HRM实验中的基因型区分。尽可能分析100 bp以下的扩增子，特别是在研究有着已知多态性的位点时。检测长扩增子中的序列变异也是可以的，然而，单碱基变异影响50 bp扩增子的程度超过了100 bp扩增子（图2）。对于两条只有一个核苷酸位点差异的序列，缩短扩增子长度能提高某一温度下的信号差异。这将提高检出特定SNP的统计置信度，获得更加可靠的数据。

图2. 扩增子长度对熔解曲线的影响。图中比较了野生型（A/A）、杂合子（A/T）和纯合子（T/T）SNP的50 bp（A）和100 bp（B）扩增子的熔解曲线图。利用较小的扩增子，提高了聚类和置信百分比。每条曲线代表了一次重复。

目前有多个程序，能帮助设计引物对，并挑出目标序列：

• Primer-BLAST – 设计寡核苷酸的免费软件，由美国NCBI开发。引物序列可与用户选定的数据库比较，以确保它们是特异针对目的基因的。
• Beacon Designer (PREMIER Biosoft International) – 市售的软件，能设计HRM特异的引物，以产生带有可检测熔解温度差异的尽可能短的扩增子。设计和验证三套引物是一个很好的做法，有可能挑选出非常可靠的一对。
• MFOLD – 检测扩增子序列，以确保它们不在PCR过程中形成二级结构。单链或部分变性DNA中的二级结构可能产生不一致的数据，并增加了熔解图解释的复杂度
• DINAMelt server – 在评估目标熔解区域复杂度时有用

PCR反应的优化

HRM分析的成功取决于PCR产物的质量以及PCR后的熔解步骤和待研究的特定序列。每个实验参数必须单独控制，以确保成功和重复的结果。在HRM分析之前，分析实时定量PCR的扩增数据可能对HRM实验的troubleshooting特别有用。我们要注意以下方面：

• 扩增子质量 – 若非特异性产物的熔解图与目标序列很相似，那么HRM软件不太可能区分出来。在扩增后生成低分辨率熔解图（0.5°C步骤），以确保只有目标扩增子被扩增，最好利用琼脂糖凝胶电泳评估每个引物对的PCR产物

• 起始模板浓度均一化 – 为了获得最佳的结果，向反应中添加相同量的模板。均一化起始浓度，这样所有扩增曲线在三个Cq内，即低于10倍范围内

• 使用经过优化的退火温度和反应效率 – 利用温度梯度优化反应，以确定适当的退火温度。反应效率应当在90%-110%

• 检查异常的扩增图 – 仔细查看异常扩增图的扩增数据。不成功的扩增可能是由反应抑制剂、染料太少或不正确的反应体系引起的。此类样品的HRM可能引起低分辨率和不好或不一致的分类

• 均一化起始扩增子浓度 – DNA片段浓度影响其熔解温度，确保每个反应已扩增到平台期，以便可靠、重复的熔解比较

• 确保样品之间的均一性 – 在一个实验中，样品必须是相同体积，包含相同浓度的结合染料。DNA熔解行为受到反应混合液中盐浓度的影响，因此所有样品中缓冲液、镁离子及其他盐的浓度都应当均一

• 收集足够的数据 – 为了更轻松地阐释数据，必须收集足够的基线数据点。以观察到的扩增产物熔解温度为中心，在至少10°C（或更多）的窗口内捕获HRM数据点。一个优秀的HRM分析软件，如Bio-Rad的Precision Melt Analysis™ 软件，能将这些过程中的大部分自动化，以确保样品之间的数据分析一致。

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