两篇Nature论文聚焦基因打靶新技术

【字体: 时间:2011年03月11日 来源:生物通

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  近日来自Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs技术进行了基因组靶向修饰相关研究,两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上。

  

    生物通报道  简化基因组的操作过程可以说是许多遗传学家的梦想。在内源序列中特异性地导入突变、标签或完整的新编码序列,从而构建出广泛适用的精密疾病模型将大大推动科学家对人类各种疾病机制的研究,开发出有潜力的治疗策略。

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    尽管锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)技术的出现促使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大步,然而目前对于许多研究者而言设计出特异性靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是一个相当大的技术挑战。近期有研究发现植物病原体中的一种转录激活子样效应因子(transcription activator–like effector ,TALE))表现出DNA结合特异性,为科学家们开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。

    与ZFN相似的是,TALEs也是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸,第12和13位残基是靶向识别的关键位点,被称作重复可变的di-residues (RVDs)位点。然而不同于每个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基, TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基。

    尽管已在植物和酵母中证实了TALEs的DNA特异性识别特性,然而研究人员一直都未曾在哺乳动物细胞中利用TALEs靶向特异的内源基因。近日来自Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs技术进行了基因组靶向修饰相关研究,两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上。

    原文摘要
    Miller, J.C. et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29, 143–148 (2011).

    ChemPort PubMed Article Zhang, F. et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nat. Biotechnol. 29, 149–153 (2011).

   “TALEs吸引我们的重要原因之一就是它们的识别密码具有模块化和简单化的特点,”Sangamo公司的首席科学家Philip Gregory说。

    在第一篇论文中,Edward Rebar领导的研究小组将带有不同C-末端TALE的截短片段连接到核酸酶FokI的催化结构域上。当研究人员将构建的TALE核酸酶靶向内源性的人类NTF3 和 CCR5 基因时,证实TALE核酸酶能够特异性地对这些基因片段进行剪切。

    哈佛大学的张峰(音译,Feng Zhang)则表示他们研究组起初只是想要检测TALEs激活内源基因的潜能,然而当他们试图通过商业机构来合成靶向目的序列的TALE时却遇到了困难。张峰回忆说他联系的公司向他表示不确定能够合成出如此多重复序列的TALEs。“在那一刻,我们确定这条道路是行不通的。我们需要找到一种更快速合成TALEs.的方法,”张峰说。随后研究小组开发了一种基于分层连接的策略来构建包含12个重复模块的TALEs。他们在保留RVDs的基础上减少了每个模块的DNA序列,同时将剩余序列的重复性降到最低。进而通过12重PCR研究人员获得了带有特异性连接序列的单体,并将其克隆至包含TALE
N-末端 和 C-末端序列的骨架载体中。为了构建TALE转录因子,研究人员又将TALE融合到一个转录因子的激活域。在接下来的靶向性检测中,研究人员证实其能特异地使四个检测内源基因中的两个基因表达上调。

    张峰表示他相信TALEs将具有广阔的应用前景,他们将致力于利用TALEs技术开发出能在动物体内检测疾病模型的新型工具。

    而Sangamo公司的Gregory则对此表示了谨慎的乐观,Gregory指出对于TALEs还有许多尚待研究之处,例如它们的脱靶活性以及基本生物特性包括结构和亲和力等。“现在还不清楚如何优化TALE。并且关于TALE是否优于ZFNs这一问题,我只能这么说我们已经投入了15-20年的时间来设计ZFNs,而投入在TALEs上的时间却仅有18个月。现在一切都还言之过早,”Gregory说。

(生物通:何嫱)

 

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