专家指路:如何预防双向凝胶中的垂直条纹[心得点评]

【字体: 时间:2011年03月24日 来源:生物通

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  在上一篇文章中,我们讨论了双向凝胶中水平条纹的各种原因,以及它的预防。水平条纹的出现可能是第一向分离时(通常在IPG胶条上开展)出现问题。这篇文章着重讨论了垂直条纹,它是由第二向分离的相关问题引起的。垂直条纹不应与双向图中的垂直缺口或空白区域相混淆。

Tom Berkelman, Mary Grace Brubacher & Haiyin Chang(Bio-Rad Laboratories, Inc.)

上一篇文章中,我们讨论了双向凝胶中水平条纹的各种原因,以及它的预防。水平条纹的出现可能是第一向分离时(通常在IPG胶条上开展)出现问题。这篇文章着重讨论了垂直条纹,它是由第二向分离的相关问题引起的。垂直条纹不应与双向图中的垂直缺口或空白区域相混淆。

蛋白溶解度差
在第一向分离之后,所有蛋白移至它们的等电点,不携带净电荷。介质的离子强度也非常低,因为小的离子已经全部迁移出第一向胶条。在这些条件下,蛋白的溶解度通常很低,尽管存在去垢剂、离液剂及其他增溶剂,蛋白仍沉淀在凝胶基质上。第一向之后的平衡步骤的主要目的是用SDS包被蛋白,让它们带上负电荷,并重新溶解,这样它们就可能进入第二向凝胶中。

蛋白上样量过大
若上样了大量蛋白,或样品中包含了特别高丰度的蛋白,那么平衡过程中的重新溶解可能不彻底,引起垂直条纹和最强蛋白点的拖尾。通过限制第一向胶条中蛋白的上样量,可预防这一点。通常可以使用更为灵敏的染色技术(例如银染或SYPRO Ruby 蛋白凝胶染色,而不是考马斯亮蓝染色)来补偿蛋白的上样量较低。在某些情况下,延长平衡时间,也能预防高丰度蛋白的垂直条纹(详见下文的“平衡效果不佳”)。

聚焦过度
等电点沉淀随聚焦时间而增加,因此通过确保第一向等电聚焦的时间不过长,可将垂直条纹降至最低程度。

平衡效果不佳
平衡应当在确保SDS渗透良好的情况下开展,从而促进蛋白溶解。平衡托盘应当振摇,以确保溶液的不停移动。如有必要,平衡可延长至45分钟。这可能导致一些小的多肽(<15 kD)的损失,但是即使平衡延长,较大蛋白的损失通常也无关紧要。SDS应当至少以2%(w/v)的浓度存在,特别是当第一向使用了高浓度(2%)的去垢剂时。平衡溶液的其他组分也相当重要。溶液应当是缓冲的,特别是采用烷基化步骤时,因为碘乙酰胺处理产生了酸。平衡的最佳pH是8.8。甘油是平衡液中特别重要的组分,应当至少以20%(v/v)的浓度存在,而它的省略将产生垂直条纹。

蛋白氧化
在双向过程的所有步骤中,应当预防氧化交联或蛋白重折叠;第二向分离中的蛋白氧化可能产生垂直条纹。在第一向聚焦之前,用ReadyPrep™ reduction-alkylation kit处理可阻断半胱氨酸的巯基,预防它们被重新氧化。如果样品未烷基化,应当在第二步平衡步骤中用2.5%碘乙酰胺进行烷基化。如果不想要烷基化,那么平衡液中应存在足够量的二硫苏糖醇(DTT),至少为1%。DTT应当在使用前立即添加到平衡液中,因为若储存,它可能会氧化。DTT在第二向条件下是带负电荷的,在凝胶中将迁移得比蛋白快,确保了分离过程的还原环境。

试剂质量不佳或配置不当的溶液
垂直条纹及其他第二向问题常常是由试剂质量不佳或溶液配置中的错误引起的。注意应使用最高质量的试剂,并验证所有缓冲液的pH。预制的第二向凝胶应当在它们的失效期之前使用。劣质的丙烯酰胺或时间久的丙烯酰胺储存液可能引起垂直条纹,因为第二向凝胶未完全聚合。重用电泳运行缓冲液可能导致分离不佳和垂直条纹,因为运行缓冲液中离子和SDS的消耗。如果垂直条纹是一个持续存在的问题,那么应当避免这种做法。

IPG胶条在第二向凝胶中放置不当
垂直条纹可能也是由IPG胶条和第二向凝胶中的空隙或IPG胶条在上样时的损坏引起的。第二向凝胶应当有着直且水平的上缘,并注意让整个IPG胶条与第二向凝胶直接接触。IPG胶条不应当在放置时扭曲。确保IPG胶条的塑胶支撑紧紧贴住第二向凝胶板,可避免这一点。应当使用琼脂糖覆盖,以避免IPG胶条松动或移动。在琼脂糖覆盖时应尽量避免气泡。

等电聚焦后IPG胶条的孔大小不均
在第一向分离后,IPG胶条的厚度常常存在差异。凝胶中的水运动引起了某些部分的鼓起或变薄(Rabiloud 2000)。在IPG胶条的较薄部分,凝胶孔可能已缩小,从而减慢或阻止了蛋白迁移出IPG胶条。这可能引起垂直条纹,更严重的是,蛋白困在IPG胶条中,导致完全的损失。确保样品已彻底脱盐,以及聚焦时间不会过长,可将第一向分离中的水运动降至最低。

垂直缺口或垂直空白条纹
就本次讨论而言,垂直缺口或空白条纹是不同于垂直条纹的。这些问题可能是由于有气泡被琼脂糖封在IPG胶条中,IPG样品缓冲液中DTT过量(>50 mM),或IPG胶条已损坏(水化不充分或操作过程中损坏)。电极附近的空白条纹,特别是阴极端,可能是由盐的集结引起的。

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参考文献
Rabilloud T (ed), Proteome Research: Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods, Springer-Verlag, p. 104 (2000)

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