陈竺外显子组测序发现白血病关键突变[创新技巧]

随着更多新一代测序仪的上市，特别是个人化测序仪（如Illumina的MiSeq，ABI的PGM和罗氏454的GS Junior）的上市，测序费用越来越低，再加上序列捕获产品也越来越丰富，使得外显子组测序的门槛越来越低。于是，过去无法开展的多种疾病中关键基因或关键突变的鉴定也成为可能。新一代测序让我们更快找到关键突变，也能更快发表高质量的文章。

上海交通大学医学院附属瑞金医院上海血液学研究所的陈竺院士和陈赛娟院士领导的研究小组近日在《Nature Genetics》上发表了一篇文章。他们利用外显子组测序（exome sequencing），发现了急性单核细胞白血病（AML-M5）中的DNA甲基转移酶基因DNMT3A突变。

尽管近年来一些研究发现抑癌基因甲基化在急性白血病中普遍存在，然而由于常规的全基因组测序技术存在着工作量大、耗时长、成本高等局限，使得目前只有少数基因的甲基化状态被确定与患者的临床特征即预后有关。外显子组测序是一种新型的基因组分析技术。由于外显子组仅占人类基因组的百分之一。测定外显子序列只需针对外显子区域的DNA即可，因此远比全基因组测序更简便、经济，近年来也开始广泛应用到遗传病的相关研究中。

在这项研究中，研究人员首先利用Ficoll梯度离心从9个AML-M5病例的骨髓样本及对照外周血中分离出单核细胞，然后从新鲜制备的细胞中抽提出基因组DNA，用于外显子组测序。

外显子组捕获是在罗氏NimbleGen的2.1M人外显子组芯片上开展的。此款芯片包含210万个探针，最多能捕获50 Mb区域。研究人员从每个外显子组中捕获出24 Mb区域。随后通过连接介导的PCR扩增这些片段，纯化后就交予Illumina平台开展DNA测序。

簇生成是在Illumina的簇生成工作站上开展的，流程如下：模板杂交、等温扩增、线性化、阻断、变性和测序引物杂交。之后，研究人员利用Illumina的Genome Analyzer IIx平台（GAIIx）对捕获的文库开展深度测序。定向区域中每个碱基的平均覆盖度为100倍，且这些碱基中的95.3%有着足够深的覆盖度（>10倍），能够进行变异体检出。

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研究人员利用内部的软件系统，将骨髓外显子组数据组中鉴定出的变异体与dbSNP和外周血对照中存在的种系变异相比较。他们鉴定出266个潜在的体细胞序列改变，包括220个单核苷酸变异（SNV）和46个小的插入或缺失（indel）。

之后，研究重点放在一些可能会影响蛋白编码序列的变化上，包括59个非无义替换和10个影响ORF完整性的indel上。对了验证，他们利用PCR直接从原始样本中扩增出相应的基因组区域，并开展Sanger测序。其中98.3%（58个）SNV被证实为体细胞突变，而80%（8个）indel被证实。至此，他们鉴定出63个基因中的66个体细胞突变，其中3个基因包含两种情况。

接下来，他们对另外5个病例（无配对正常样本）开展了外显子组测序，着重研究那63个基因。为了排除稀有SNP，他们又对509个对照样本进行了分析。之后，研究人员对另外98个病例（M5验证组）的骨髓DNA样本进行基因分型。结果，他们在14个基因中发现了体细胞突变或很可能的体细胞突变，每个突变都至少在两个病例中检测到。

通过上述数据的整合，并综合文献研究，研究人员选择出6个基因（DNMT3A, NSD1, GATA2, CCND3, ATP2A2 和C10orf2），并对M5验证组中它们的编码区域进行测序。在编码DNA甲基转移酶的DNMT3A中，研究人员鉴定出多个变异，其中p.Arg882His、p.Arg882Cys和 p.Val897Asp被证实由体细胞突变产生，而p.Arg478Trp、p.Gly543Cys和p.Arg882Ser不存在与对照验证组中，因此很可能是由体细胞突变产生。这样，112个病例中的23例存在DNMT3A突变，突变频率为20.5%。

DNMT3A突变体功能分析结果显示酶活性减少，或与组蛋白H3的亲和力异常。值得一提的是，研究人员证实DNMT3A突变样本中的DNA甲基化模式和/或基因表达谱均发生了改变。DNMT3A突变与急性白血病高发病率及预后不良有着密切的关系。此外，研究人员还在筛查其他白血病亚型时发现13.6%的急性粒细胞白血病（AML-M4）的病例存在Arg882改变。

这一研究发现证实了异常的DNA甲基化转移酶活性与急性单核细胞性白血病发病密切相关，并为疾病的诊断和预后评价提供了一个有潜力的生物标记。

大规模并行测序技术的开发让癌症的突变测定变得可行，然而，全基因组测序工作量大，耗时长，成本高，关键是数据分析也相当复杂，面对海量的数据，你根本无从下手。外显子组捕获工具的出现，让致病基因的发现变得简单。科学家们普遍认为外显子组测序比全基因组测序更有优势，不仅仅是费用更低，数据的阐释也更为简单。

在过去的两年内，研究人员利用外显子组测序，发现了多种孟德尔疾病及更为复杂疾病（如癌症）的关键基因。这种技术也被《Science》杂志评为2010年十大科学突破。如今，新一代测序的费用越来越低，序列捕获的产品也越来越丰富，使得外显子组测序的门槛越来越低。相信在不久的将来，国内也能利用这种技术发现更多疾病的秘密。（生物通 余亮）