汤姆森小组公布iPSC培养的优化条件

iPSC的创始人之一，美国威斯康辛大学麦迪逊分校的James Thomson教授领导的研究小组对iPSC的培养条件进行了优化，开发出一种完全限定的培养基E8。该成果近日发表在《Nature Methods》在线版上。这种培养基降低了费用且简化了质量控制，并有利于人多能干细胞从基础研究到临床研究的转化。

　　

人胚胎干细胞（ESC）和人诱导多能干细胞（iPSC）能够无限增殖，并维持生成三个胚层的潜能，有望用来修复那些被疾病和创伤所破坏的各种各样的细胞和组织，从而成为目前研究的热点。

对于iPSC的培养来说，过去几年一直是采用ESC的培养条件，如TeSR培养基。尽管TeSR培养基能够在没有动物蛋白的情况下支持干细胞的生长，但其中添加了人血清白蛋白和人源基质蛋白，这就使得培养条件极其昂贵，不适合日常使用。因此，很多实验室还是在Matrigel上用BSA培养ESC和iPSC。

然而，因为来源问题，这些培养基成分可能会随批次而变化，那么在使用新批次之前必须进行大量的质量控制，而由于这些成分的批次差异，使用同一种培养基的不同实验室可能得到完全不同的结果。白蛋白的批次差异特别成问题，因此它在培养基中的浓度很高，而且它能与脂类及其他杂质结合。

针对这些问题，iPSC的创始人之一，美国威斯康辛大学麦迪逊分校的James Thomson教授领导的研究小组对iPSC的培养条件进行了优化，开发出一种完全限定的培养基E8。该成果近日发表在《Nature Methods》在线版上。

研究小组首先希望去除培养基中的白蛋白，但BSA的去除会导致细胞死亡。这表明BSA直接有助于细胞存活，或着BSA抵消了培养基中其他成分的毒性作用。实验结果表明，当BSA和BME同时去除后，ESC可以存活和增殖。

接下来，他们继续研究其他成分。胰岛素和FGF2对细胞存活和增殖很重要。维生素C促进了ESC增殖，而硒对细胞扩增很关键。他们还比较了12种不同的基础培养基，发现还是DMEM/F12最好。在添加了胰岛素、FGF2、维生素C和硒的DMEM/F12培养基（用NaHCO3调pH）中，研究人员能够扩增人ESC和iPSC，但在长期传代后偶尔有分化。因此，他们又添加了转铁蛋白和TGFβ（或Nodal），形成了最终的E8培养基。这种培养基能够支持人ESC和iPSC的未分化增殖。

对于基质蛋白，目前也有很多选择，包括层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白和纤维粘连蛋白，以及一些合成的表面。这些材料中的大部分都很昂贵，不适合大规模使用。由于玻璃粘连蛋白（vitronectin）相对比较容易过表达和纯化，于是研究人员检验了几种此蛋白的变异体，并发现其中两种（VTN-NC和VTN-N）能够支持人ESC的粘附和生长。在后续实验中，他们都使用VTN-NC。

使用E8这种新培养基以及玻璃粘连蛋白包被的表面，研究人员证实了人iPSC的诱导效率改善。利用附加体方法，每106个最初转染的成纤维细胞能生成4-200个iPSC克隆。

由于E8培养基降低了费用且简化了质量控制，Thomson实验室目前使用它进行人ESC和iPSC的常规培养。这种简化的培养基也使得自我更新、细胞死亡和分化等通路研究有了更干净的背景，并支持显著改善的重编程效率。另外，由于E8是高度限定的，它还有利于人多能干细胞从基础研究到临床研究的转化。（生物通 余亮）

原文摘要：

Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture

Nature Methods (2011) doi:10.1038/nmeth.1593

摘要：
We re-examine the individual components for human embryonic stem cell (ESC) and induced pluripotent stem cell (iPSC) culture and formulate a cell culture system in which all protein reagents for liquid media, attachment surfaces and splitting are chemically defined. A major improvement is the lack of a serum albumin component, as variations in either animal- or human-sourced albumin batches have previously plagued human ESC and iPSC culture with inconsistencies. Using this new medium (E8) and vitronectin-coated surfaces, we demonstrate improved derivation efficiencies of vector-free human iPSCs with an episomal approach. This simplified E8 medium should facilitate both the research use and clinical applications of human ESCs and iPSCs and their derivatives, and should be applicable to other reprogramming methods.