基于液滴的纳升体积的微细管蛋白结晶系统（MPCS）[创新技巧]

Cory J. Gerdts, Mark Elliott, Scott Lovell, Mark B. Mixon, Alberto J. Napuli, Bart L. Staker, Peter Nollert and Lance Stewart

MPCS是一项全新的基于液滴的结晶技术，他可以在塑料器皿中达到纳升体积的结晶条件筛选，并且结晶体容易收获从而用于传统的冷冻和X射线衍射数据的收集。在这种塑料器皿中生长的蛋白质晶体可以直接进行下游的原位x射线衍射分析研究。MPCS能够整合结晶混合液用于结晶化实验。在微流控聚四氟乙烯管或塑料CrystalCard上大约会产生10-20nL液滴，每一个液滴代表一批使用不同化学组分的结晶实验。结晶实验中所有的蛋白样品全部使用。在一个完整的混合（‘hybrid’）结晶实验中会联合使用稀疏矩阵筛选和化学梯度筛选。该技术有助于使用高粒度梯度筛选优化，使用优化试剂如沉淀剂，配合体或冷冻保护剂。

1. 引言
结构生物学领域每年都会产生增加吞吐量和效率的新技术。这样的发展最初的目标是从基因到三维结构只需三天。为了提高效率，人们可能希望尽量减少所需的蛋白量，这样可以从无细胞合成种得到充足的材料用于结晶筛选和优化。正因为'three-day”结构的目标，ATCG3D致力于发展多种技术来增加基因到结构的效率，包括合成基因设计(Gene Composer; http://www.genecomposer.net/)，蛋白质晶体成像(DETECT-X; Emerald BioSystems)和微流控纳升体积结晶 (The Microcapillary Protein Crystallization System; MPCS)。这里，我们第一次描述了MPCS的工作原理，它由微量调节注射器泵系统，泵系统的相关软件（(MicroPlugger)和塑料的CrystalCards组成，CrystalCards包括‘3+1 mixer’(这里进行试剂的结合)和微流体通道（结晶体存储）。CrystalCards的制造材料能够使X射线传输光学清晰，塑模性能和耐化学腐蚀性能和表面能量的平衡。该系统可以生产用于衍射的结晶体，可以从CrystalCards收获结晶体或使用CrystalCards上的样品衍射数据进行原位X射线衍射和结构溶解。

2. 背景
我们这里讨论的微流纳升结晶技术发展于芝加哥大学(ATCG3D- Ismagilov合作实验室)。水溶液滴，这里叫做液滴（plug），微水相结合的形式，自发的流出与生物惰性碳氟化合物溶液不相溶 (Song et al., 2003; Tice et al., 2003, 2004)。蛋白质、缓冲液和沉淀剂是通过三个独立的单一通道同时流出，这里通过控制不溶的和生物惰性氟碳化合物的流量打破了水流相形成10-20nL的微配液形式的结晶 (图1a; Zheng et al., 2003; Zheng, Tice, Roach et al., 2004)。这个区域的水流称为‘3+1 mixer’。10-20nL的结晶体液滴在‘3+1 mixer’中形成，同时进行结晶体培养和检测（图1b）。通过控制流量，产生一系列很好的浓度梯度的液滴（图1c），允许检测仪仔细探测结晶相空间用于结晶体优化。基于液滴的结晶体允许使用预先形成的液滴进行稀疏矩阵筛选（Zheng & Ismagilov, 2005; Zheng, Tice & Ismagilov, 2004），通过芯片上形成的液滴混合物和结合稀疏矩阵和梯度筛选叫做‘hybrid method’ （Li et al., 2006)形成适宜的浓度梯度（Zheng et al., 2003)。后者,可以在一个单独的结晶实验中全面的筛选结晶相空间。基于液滴的微流结晶也被用于探索蛋白结晶晶核形成（Chen et al.,2005; Zheng et al., 2005; Gerdts et al., 2006）和新蛋白结构的结晶产生的科学问题（erdts et al., 2006)。

 
图1：使用MPCS的基于液滴的蛋白结晶。（a）结晶实验中在CrystalCard上形成的液滴。（b）MPCS CrystalCard上着色的结晶体。（c）使用low-pH buffer，high- pH buffer和universal pH buffer指示剂在CrystalCard通道（左）形成的pH梯度（右）。

3. MPCS
作为一个技术开发中心，ATCG3D开发微细管蛋白质结晶系统（MPCS）是为了发展一种基于液滴的蛋白结晶技术应用于科学研究。这个MPCS仪器主要由三个部分组成（图2）：（1）一个泵系统，（2）MicroPlugger软件和（3）CrystalCard。泵系统是一个四通道注射泵系统，可以提供精确的和连续的液流流入MPCS CrystalCard。该系统可以独立的控制每一个通道而且可以产生极好的梯度。泵由MicroPlugger软件控制（图2b）。MicroPlugger软件允许操作者通过四种不同的操作模式控制泵系统：Prime Mode (for priming the lines),Constant Mode (for constant-flow experiments), Gradient Mode (for generation of fine gradients) and Hybrid Mode (for sparse-matrix screening using the hybrid method)。这些操作模式适用于所有的MPCS实验。第三个重要的成分是CrystalCard (Figs. 2c and 2d),这是一种微流芯片，这里水和氟溶液可以在3+1 mixer中自发形成10-20nL液滴。CrystalCard的设计是一种疏水表面，用于形成液滴并且有一条很长的微流控毛细管储存和检验。用于衍射的结晶体可以通过从CrystalCard 进行物理提取或进行原位X射线衍射。有两种形式的MPCS CrystalCard：一种是塑料CrystalCard，另一种是PDMS /聚四氟乙烯CrystalCard。塑料CrystalCard （图2c）主要用于fine-gradient screening，PDMS /聚四氟乙烯CrystalCard（图2d）主要用于hybrid screening和detergent-based的膜蛋白形式（PDMS /聚四氟乙烯CrystalCard必要的连接形式和表面属性要兼容杂交筛选和detergent-based的结晶）。

 
图2：MPCS组成。（a）MPCS系统组成图。（b）MicroPlugger软件操作模式截图。（c）充满着色的蛋白结晶的MPCS CrystalCard。（d）PDMS/聚四氟乙烯CrystalCard用于hybrid方法。

使用泵系统、软件和CrystalCards，MPCS几分钟内会产生数以百计的不同的MPCS结晶，避免交叉污染,只需使用5微升的蛋白质溶液。MPCS不浪费宝贵的蛋白，因为系统中没有蛋白体积的浪费：蛋白样品吸气直接进入聚四氟乙烯针，然后全部转移到CrystalCard。MPCS的另一个特征是可以形成微量体积的结晶核（Gerdts et al., 2006）和控制CrystalCard存储容器的湿度。（CrystalCards储存于加湿容器中至少可以保持两个月不变）。

3.1 MPCS实验
使用MPCS microbatch-style结晶实验形成液滴，这里蛋白质和结晶试剂融合并且使用油（氟化合物FC40; Li et al., 2006; Yadav et al., 2005)包被培养。MPCS有两种类型的结晶筛选：fine-gradient screening 和 hybrid screening。

3.1.1 Fine-gradient/optimization screening
MPCS梯度模式允许检晶仪非常精细扫描结晶相空间。因为在MPCS实验中水流的控制是使用MPCS泵系统和MicroPlugger软件单独控制的，而且，通过改变单独通道的流量，很容易形成一系列液滴的浓度梯度（图1c; Zheng et al., 2003)。尽管沉淀剂流量的减少，缓冲液流量的增加，但总的流量保持不变(虽然MicroPlugger软件允许用户设计一个定制的实验来适应他们的需求,包括改变形状或总和的水流动速率)。使用Fine-gradient，一个特殊的蛋白质-沉淀剂结合的结晶相空间可以仔细用于结晶优化或绘制出从微晶体到单晶的过渡（图3）。同样的方法，所谓的反向筛选可以使用两种结晶混合物促进结晶体的形成（Stura et al., 1994）。芯片的浓度梯度可以使用沉淀剂、配合体、protein partners或保护剂。为减少用于结晶优化的蛋白质体积，Fine-gradient可以减少蛋白需要，当需要形成不同的蛋白质晶体复合物或DNA突变时是必需的。

 
图3：应用Fine-gradient形成的磷酸核糖焦磷酸激酶结晶相图。从沉淀剂（左下）到微晶沉淀剂（右下）到微晶体（左中）到少量结晶体（右上）到单晶（左上）沉淀剂梯度表现出平稳的过渡。

3.1.2 hybrid screening
hybrid screening结合芯片形式的稀疏矩阵筛选梯度（Li et al., 2006）。稀疏矩阵筛选是不同结晶剂组成的液滴要通过形成一个‘pre-formed cartridge’实现（Zheng & Ismagilov, 2005)。在MPCS hybrid screenin方法中，pre-formed cartridge包括一系列~100nL的液滴进入3+1 mixer的一个。使用Microplugger软件的Hybrid模型，pre-formed cartridge中每一个结晶试剂的浓度梯度通过改变预先形成的液滴和缓冲液的流量。在相同的实验中进行稀疏矩阵和梯度筛选时允许MPCS扫描大块结晶相空间，每一个预先形成的结晶体液滴的不同浓度可以20-40个单独的结晶。

4. 产生用于衍射的结晶体
MPCS是一个低体积蛋白结晶筛选工具：他可以产生用于衍射的结晶体。虽然实验体积（10-20nL；准确的体积依赖于CrystalCard和流量）远远小于传统的结晶技术。但是，10-20nL液滴包含足够的蛋白用于结晶，已经足够获得有用的X射线衍射数据。液滴中结晶沿着最长的轴生长40–200 µm（通道的尺寸为200×200µm）。因为结晶体用于衍射实验，关键是要有方法获取衍射数据，并且不需要增加实验或阻碍另一个实验技术。MPCS提供两种方法用于获得X射线衍射数据：传统的冷冻结晶提取和原位衍射。

4.1从MPCS CrystalCard提取蛋白结晶
蛋白质结晶体可以直接从MPCS CrystalCard上单独的液滴提取。一个薄的塑料层粘合与塑料板上，包含微流电路。这一薄层有一个粘合剂，这种设计可以防止在结晶实验中液体从CrystalCard流出，缺点是需要手工剥去（图4a和4b）。此外,液滴保留在塑料部分包含了微电路。薄的塑料层被剥离后，结晶体露了出来，而且理想的结晶体可以通过微小的工具如cryoloops收获（图4c和4d）。两种技术可以用于移除冷冻保护的结晶体：（1）结晶体可以和cryoloop仪器取出放置在理想的冷冻保护剂中或者（2）可以吸取大约1微升冷冻保护剂在包含结晶体的液滴的顶部，这样当结晶体取出时他已经沉淀在冷冻保护剂中。使用第一种技术，通过碳氟油层可以使液滴的蒸发延迟5min。使用第二种技术，液滴的蒸发延迟至少20分钟，可样可以有充裕的时间来提取许多结晶。

 
图4:从MPCS CrystalCard上提取用于衍射的结晶体。（a）从MPCS CrystalCard剥离的薄的塑料覆盖层图片。（b）打开的CrystalCard，所有的结晶保存与塑料板上包含微液流电路。使用cryoloop从CrystalCard上取出结晶体。（d）在cryoloop中的结晶体。

结晶提取使用MPCS fine-gradient screening产生蛋氨酸-R-亚砜还原酶结晶体（图5a）。结晶体形成的梯度筛选的浓度优化为30%(v/v) MPD，25%(w/v) PEG 1500, 0.1 M醋酸盐（pH4.5）。蛋白浓度为22 mg ml-1（20 mM HEPES pH 7.0,500 mM NaCl, 5% glycerol, 2 mM DTT）。结晶体的提取使用0.1-0.2mm的cryoloop，低温冷冻（使用crystallant作为冷冻保护剂）且用于X射线衍射实验。一个1.7 A ˚数据集在beamline SBC-CAT 19BM上获取（阿贡国家实验室的APS（Advanced Photon Source）,随后得到了其结构（图5b和5c，表1）。最后的调整和结构因素都提交于蛋白数据库中（PDB code 3cxk)。

 
图5：蛋氨酸-R-亚砜还原酶。（a）蛋氨酸-R-亚砜还原酶结晶体图。（b）半胱氨酸残基和锌离子（3ό）F0-FC OMIT轮廓图。（c）Burkholderia pseudomallei中得到的蛋氨酸-R-亚砜还原酶NCS二聚体的连续剖面图。黄球体代表锌离子，球状和棒状体代表醋酸盐离子。结构提交于PDB（3cxk）。
 
4.2 原位X射线衍射
CrystalCard的设计允许进行原位X射线衍射。这允许检晶仪在改为冷冻保护之前评估结晶体的生长质量并且进行结晶体结构测定的数据采集(Luft et al., 1999; McPherson, 2000; Ng et al., 2003; Yadav et al., 2005; Lunde et al., 2008)。CrystalCard在室温下足够透过X射线直接安装在测角器上。此外，CrystalCard能够顺着X和y轴从多重结晶体重采集数据，用于组合产生的复杂数据集。CrystalCard可以旋转75度，不会碰到横梁。为了证实这种方法，我们在NE-CAT beamline 24ID-C（阿贡国家实验室的APS）（图6a）CrystalCard 上包含溶解酵素的结晶体并且在室温下从CrystalCard上的三个结晶体收集X射线衍射数据。CrystalCard.部分分子替换的电子密度图见图6（b）。晶体的数据在表1中列出。

 
图6：使用MPCS进行的原位衍射。(a)MPCS CrystalCard安装在有X射线源的测角计头上。（b）从 MPCS CrystalCard上的三个结晶体收集的X射线衍射数据得到的部分分子替换的电子密度图。
 
5. 材料和方法

5.1 准备塑料CrystalCard
塑料CrystalCard通过喷射模塑法(Siloam Biosciences Inc.)制作。液滴在CrystalCard中形成需要低表面能（疏水的）。这样可以确保氟碳油优先湿润微细管壁。聚碳酸酯CrystalCard从厂家运来时有高表面能（疏水的）。为使微细管表面用于液滴形成，Cytonix PFC 502AFA溶液用于涂抹微细管内部。Cytonix PFC 502AFA粘附在聚碳酸酯表面，而且保持表面能6–10 dyn cm-1（1 dyn cm-1 = 1×10-3N m-1）。有涂层后，CrystalCard充满Cytonix PFC 502AFA溶液，然后在冰上培养2小时（CrystalCard入口在高温下容易破裂）。502AFA溶液从CrystalCard 移除时要通过34.5 kPa 真空干燥1小时。烘干后，CrystalCard在333k处理一小时后备用。

5.2 Macro-micro界面
Macro-micro界面连接注射器和CrystalCard用于MPCS正常运转。360µm内径，760µm外径(ID/OD 360/760)的聚四氟乙烯管用于连接注射器和CrystalCard。聚四氟乙烯管的一端接到注射器针头上，另一端接入一个760毫米内径硅片管道连接到塑料CrystalCard。PDMS/聚四氟乙烯CrystalCard紧密结合ID/OD 360/760聚四氟乙烯管。

5.3 准备hybrid方法pre-formed cartridge(Li et al., 2006)
一个5-10cm的ID/OD 360/760聚四氟乙烯管连接50µL的注射器，另一头是10cm的内/外径比为200µm/230µm（(ID/OD 200/230) 聚四氟乙烯存储管。连接处有密封的毛细管蜡（(Hampton Research)。注射器和管充满FC40（3M）并且注射器安有一个手动的吸液器(Stoelting No. 262M=, Wood Dale, Illinois, USA)。ID/OD 200/230聚四氟乙烯存储毛细管末端用于第一次沉淀剂浸入而且150nL液体（15 units on the aspirator）被吸收。大约50nL气泡（5 units on the aspirator）被吸收。

这个过程会重复，直到所有的理想的沉淀剂（多达24）全部被吸收。2µLFC40（大约200 units在吸附器上）吸入管内，注射器置于泵上用于实验。ID/OD 200/230聚四氟乙烯存储毛细管包括预先形成的cartridge连接在PDMS/聚四氟乙烯CrystalCard沉淀剂入口，使用刀片剪通道插入毛细管水平位置。ID/OD 200/230聚四氟乙烯存储毛细管插入到PDMS芯片（进口的地方，在这一点变得锥形）并且使用毛细管蜡密封。

5.4 结构测定
数据集采集于APS（Advanced Photon Source）：beamline 19BM（100K）用于蛋氨酸-R-亚砜还原酶，beamline 24-IDC（室温）用于溶菌酶。数据在HKL-2000（(Otwinowski & Minor, 1997)上进行整合。溶菌酶的结构,强度分别使用MOSFLM package采集三个数据集(Leslie, 1992)。溶菌酶和蛋氨酸-R-亚砜还原酶的结构分别使用MOLREP(Vagin & Teplyakov, 1997)PDB entries 1iee和3cez研究模型进行分子替换。结构精炼使用REFMAC5(Murshudov et al., 1997)，模型构建使用Coot(Emsley & Cowtan, 2004)。

5.5 CrystalCard X射线吸收
使用一个简单的测试分析CrystalCard X射线吸收。为了做到这一点，离子束的射束电流规范化到APS环形电流（I/I0）。测定用或不用CrystalCard，波长为0.979261 A ˚时插入(12.66099 keV)。不用CrystalCard的I/I0为1.91671×10-6，用CrystalCard的I/I0为1.5511×10-6。这样x射线的19%被CrystalCard吸收。

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