5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的研究工具[新品推荐]

除了大家熟悉的5-mC，现在更多的研究人员将目光移向了另一种表观遗传学修饰——5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。5-hmC是5-mC的羟基化形式，1952年在噬菌体DNA中首次发现。几十年来，羟甲基胞嘧啶的研究一直围绕着它对于噬菌体DNA的保护作用。直至最近，研究人员才发现它在人和小鼠大脑以及胚胎干细胞中广泛存在，可通过TET家族的酶对5-mC的氧化而产生。

一些人将5-mC称为第五种碱基，那么5-hmC就是第六种碱基。这种碱基的确切功能仍在研究中，但普遍认为它参与了DNA去甲基化或基因表达调控。之前，一直缺乏一种技术来准确灵敏地检测5-hmC，如今，多家公司推出了相关的检测工具。

New England Biolabs（NEB）公司推出了一套经过验证的EpiMark™ 产品，其中EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit可鉴定并检测特定位点的5-hmC和5-mC。此试剂盒操作简便，只需三步，是市场上第一个定量5-hmC的PCR型分析。因此，它也被生物通读者评为“2010生命科学十大创新产品”。索取资料

它利用T4 β-葡萄糖基转移酶（T4-BGT）在5-hmC的羟基上添加葡萄糖，从而区分5-mC和5-hmC。当5-hmC出现在CCGG的背景下，这种修饰将一个可切割的MspI位点转化成不可切割的。具体分析过程如下图：

第1步：糖基化
基因组DNA用T4-BGT处理，让所有5-hmC糖基化，产生5-ghmC。这个反应是序列无关的，因此所有5-hmC都将糖基化，未修饰或5-mC DNA则不受影响。

第2步：限制性内切酶消化
MspI和HpaII识别相同的序列（CCGG），但是对不同的甲基化状态敏感。HpaII只切割完全未修饰的位点，胞嘧啶上的任何修饰（5-mC、5-hmC或5-ghmC）都阻碍切割。MspI则识别并切割5-mC和5-hmC，5-ghmC除外。

第3步：PCR分析
用引物扩增实验的靶DNA和对照的靶DNA。如果CpG位点含有5-羟甲基胞嘧啶，那么糖基化和消化之后检测到条带，但是未糖基化的对照反应中没有。如果使用实时定量PCR，那么就可以估计这个位点大概有多少羟甲基胞嘧啶。

Zymo Research公司也推出了两个试剂盒：Quest 5-hmC Detection Kit和Quest 5-hmC Detection Kit-Lite，原理大致同上。这两款试剂盒的区别在于前一款包含了MspI，而后一款不包含对5-ghmC敏感的限制性内切酶，你可自由选择一个。内切酶处理之后，可开展多种下游分析，如qPCR、新一代测序、Southern杂交、芯片等。

而对于全基因组范围内的5-hmC分布，研究人员最近也开发出了一些新的研究方法。

据《Nature》杂志报道，波士顿儿童医院等机构的研究人员开发出两种方法，来分析5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）的基因组定位¹。

第一种方法称为GLIB。GLIB是糖基化、高碘酸氧化和生物素化的缩写。它主要利用一些酶和化学反应的组合来分离出包含单个5-hmC的DNA片段。首先利用T4噬菌体β-葡萄糖基转移酶（BGT）在每个5-hmC上添加一个葡萄糖分子，然后用高碘酸钠氧化葡萄糖，它将邻近的羟基转化成醛基，之后用醛基反应性探针进一步修饰，在每个5-hmC上添加两个生物素分子，并利用链霉亲和素来pull down。

第二种方法是通过亚硫酸氢钠处理基因组DNA，将5-hmC转换成5-亚甲基磺酸胞嘧啶（CMS），然后利用CMS特异的抗血清将包含CMS的DNA免疫沉淀。

之后，研究人员对小鼠胚胎干细胞中包含5-hmC的片段进行高通量测序。对于GLIB处理的DNA，他们使用了Helicos单分子DNA测序，这种方法不需要扩增步骤，从而避免了PCR偏向。对于CMS富集的基因组DNA，他们使用了Illumina测序仪，其较长的读长适合亚硫酸氢盐处理的DNA与基因组的高效比对。

研究人员发现，片段主要集中在外显子和转录起始位点附近。5-hmC尤其集中在启动子含有组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3）和组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）这两个标记的基因起始位点。

有了这些新工具，相信第六种碱基的研究会越来越简单。（生物通 余亮）

参考文献：

1. William A. Pastor, Utz J. Pape, Yun Huang, Hope R. Henderson, Ryan Lister, Myunggon Ko, Erin M. McLoughlin, Yevgeny Brudno, Sahasransu Mahapatra, Philipp Kapranov, Mamta Tahiliani, George Q. Daley, X. Shirley Liu, Joseph R. Ecker, Patrice M. Milos, Suneet Agarwal & Anjana Rao Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature 2011, 473: 394–397.