时域体内荧光成像技术应用于实验性脑中风血脑屏障的动态分析[创新技巧]

摘要: 脑缺血后血脑屏障可用于传递显像剂和疗法进入大脑。本研究的目的一是建立新的体内光学成像方法，用来纵向评价血脑屏障，二是评价经过短暂的局部脑缺血后血脑屏障的大小选择和时间模式。使用体内时域光学近红外成像技术来评价血脑屏障的渗透性，经过60分钟或20分钟短暂的大脑中动脉闭塞（MCAO）和不同时间的再灌注（长达14天），不论使用Cy5.5（1kDa）还是Cy5.5与牛血清蛋白（BSA）联合使用（67kDa）都表现出对比度增强。体内成像的观察同时用体外大脑成像和荧光示踪剂外溢的显微观察来验证。Cy5.5体内光学对比度增强的空间要大于实用BSA-Cy5.5。进过短暂的20分钟的MCAO后的纵向研究表现出双向的缺血屏障，身体同侧半球表现明显，7天达到顶峰，缺血后14天后恢复。BBB大分子和小分子区域的不同，可以潜在的应用于替代成像标记物，来评价梗塞前组织，这样可以用来选择神经保护疗法的适宜大小。

静脉溶栓是治疗急性缺血性中风的唯一方法，在发病3小时之内治疗疗效最佳。神经保护疗法的目的是缓解组织损害或延长3小时溶栓治疗没有明显的临床疗效的存活时间。这一问题由于缺乏临床实验证据而会更加严重，这些疗法通过完整无缺的或受损的血脑屏障进入大脑靶目标。

成像技术的加速发展能够加速严重的缺血性中风的治疗，可以作出更精确的初步评价，能够更好的选择和监视经过溶栓的患者，更好的使病人分阶段进行临床治疗。CT和磁共振成像（MRI）常用于临床，分子成像技术（单光子发射计算机断层成像术和正电子发射断层成像术及MRI分子影像）目前在评价急性脑中风患者时还有一定的局限性，这是因为缺乏神经病学的分子替代物和分子成像显影剂。最近，中风的亚急性阶段炎症的成像的应用结果表明，超小顺磁性氧化铁（USPIO）纳米微粒可作为巨噬细胞MRI对比剂。光学成像技术在评估脑灌注/氧化的作用目前局限于近红外光谱分析，通过进行组织荧光团（(血红蛋白和细胞色素aa3)吸收红外线进行大脑氧化的非侵评价。而常因缺乏组织渗透性和高光散色而阻碍光学成像技术的应用。在一定程度上这一局限性可以通过近红外光缓解，允许更深的组织渗透性，可以渗透数厘米，并且可以通过荧光而不是他的密度来分析时域光学特征。探针的荧光寿命(t)是指探针从激发态回到基态的时间。荧光寿命是探针内在的参数，不受探针浓度的影响，但是对组织微环境敏感。

大脑毛细血管内皮控制血液和大脑软组织分子的交换。血脑屏障有重要的临床意义，因为许多脑部疾病，包括中风，与不同分子大小的渗透性增加相关，从而导致血管源性水肿；此外，血脑屏障限制药物进入大脑，通过紧密的连接和主动转运通过ABC输送。因此，非侵研究大脑缺血屏障区域分布，大小选择和时间动力学有助于确定系统的治疗方法在发展过程中或疾病进展到达目标薄壁组织。本研究的目的是证实时域光学体内成像技术的发展和实用性，有或没有光学图像对比度增强，检测或定位中风包括大脑注入，确定中风实验模型中动力学以及血脑屏障的程度。

1.  材料和方法

1.1 大脑中动脉闭塞的老鼠
所有使用的动物都是被动物保健委员会制度认可的并且遵循加拿大动物保健委员会的指导方针。雄鼠CD-1（23-25g）从查尔斯河获得并在当地繁殖。使用含有1.5%异氟醚和含有69%N2O和30%O2终浓度为1.0%的异氟醚的喷雾器进行麻醉诱导。使用内部发光细丝进行左侧大脑中动脉闭塞。简单地说就是用一个11毫米的涂有硅酮的尼龙线插入到一只麻醉的老鼠左颈动脉，直接进入颈内动脉颅外段，直到它堵塞了血液流向大脑中动脉(MCA)。20或60分钟缺血之后，动物被短暂的麻醉。

颅血流量的测量采用先进的激光流量计（ALF21， ADVANCE有限责任公司，日本东京)。简单的说，就是使用异氟醚麻醉之后皮肤覆盖颅脑收缩。利用0.5毫米光纤探针通过完好无损的颅骨，通过MCA对大脑皮层由右至左半球大约7毫米侧面到中部和2毫米后部到前囟精确定位。基线血流(脑血流量值)被定义为100%的流动和采取立即开始前颈内动脉闭塞的外科手术。MCAO开始测量后，在10、20、40、50 和59分钟读数。额外读数资料都被去除，大约是65 ,80,100,120分钟后的测量。小鼠在整个实验过程中保持全身麻醉，使用恒温的毯子使身体(直肠)温度维持在37度和38度。生理参数测定，包括血压、血液气体、酸碱度。另外一只老鼠进行模拟手术,对其进行同样的脑部手术,但是没有进行MCAO,作为对照。在不同的再灌注时间（长达14天）来分析经过短暂的血脑屏障渗透性和大脑注入的结果。

1.2 TTC组织化学染色
为了使经过短暂的MCAO后的局部缺血性损伤更加形象化，大脑被移除，并使用鼠标不锈钢冠状脑模型用四个两毫米厚的花冠状切片剖面，使用有喙的边缘作为一个标志。截面浸泡在2%的TTC溶液中，37 ° C 浸泡15分钟以促进着色。然后从溶液中取出进行数码拍照。缺少TTC着色的梗塞区域使用成像软件Axiovision 4.6测量并使用4个2毫米厚的切片来计算总梗塞面积。

1.3 体内时域光学成像
小动物时域光学成像系统Optix MX2((Advanced Research Technologies, Montreal, QC)用于体内成像。Optix MX2既可以探测荧光探针信号强度数据，又可以给出荧光探针所处的位置深度数据。

用体内时域近红外光学成像技术评价BBB的渗透率和/或脑损伤，两个成像模式用于测试经过短暂的MCAO后的小鼠：（1）光学成像采用对比度增强的近红外探针；（2）光学成像测量变化无对比度增强的内源性荧光团。

MCAO前小鼠先使用eXplore Optix成像得到背景图像。动物经过MCAO或重新注入近红外荧光探针Cy5.5（100nmol）（分子量=1kDa；荧光寿命=1.0ns；GE Healthcare，Milwaukee, WI）或者在用Optix进行成像程序前以等体积的生理盐水处理尾静脉15分钟。为确定血脑屏障的不同的分子大小，在一些研究中使用带有Cy5.5标记的牛血清蛋白（BSA-cy5.5,50mg静脉内的）（MW=67kDa）用来增加图像的对比度。同样，对照组也在成像前经过15min的处理，然后注入100nmol的cy5.5或在适宜的时间注入50mg BSAcy5.5。在纵向研究中，在一段时间内进行重复成像，cy5.5（100nmol）总是在成像之前15min注入（时间的比例最高的信号的背景）。在所有的成像实验中,都重复频率为80MHz的670nm脉冲激光二极管和时间分辨12 ps的光脉冲进行激发。当荧光发射在700nm时被高灵敏度的单光子计数器和快速光电倍增管检测。每一个动物都放置在一个倾斜的板上，然后放入加热的（36℃）的成像系统中。动物的最佳的图像都是通过侧面的数字照相机检测。一个二维的扫描区域包括头部都通过顶端的实时数字照相机选择。激光激发通过振镜片进行光束控制，然后移动选择感兴趣的区域（ROI）。每一个像素的激光功率和计算时间在分别在60mW和0.5秒。光栅扫描间隔为1毫米，而且在获得每一个画面时都保持不变。每一个感兴趣的区域扫描300点。数据记录为时间点分布函数，而且图像可以重建如荧光强度（FI），荧光寿命（t）和荧光浓度图（Conc）。

2.  数据分析

每一个动物脑缺血损伤的诱导之前都要通过背景图像采集的基线，之后再后续的成像中去除。前和后注入的图像都被eXplore Optix Optiview 2.1软件自动记录图像(ART Inc, Montreal, QC)，可以排除背景干扰。

每一个成像参数(FI、t、Conc)的测量都是用相同的ROI缺血性左半球和对侧的大脑右半球。经过MCAO后的梗塞区域都依据文献中的描述通过数字地图创建。每只动物的测量区域尽量调整到相同的大小。

FI可以用任意单位代表，反应出光子数，通过激光功率和整合时间，通过以下方式计算光子数÷（激光强度(W)×整合时间（s）。ART公司的3D重建软件用于图像构建，可以从动物轮廓图探测深度和估算Cy5.5浓度。使用小鼠脑组织吸收系数（mua）和减少散色系数（musp）值来确定荧光基团的深度和浓度信息，分别是0.03 mm–1 和 1.5 mm–1。分析的重点集中在荧光基团TPSF最小值和最大值的位置，假设，tTPSF最大值反应的几何图形不依赖于荧光基团的浓度但是滞后如荧光基团的深度增加。因此，荧光基团的深度可以用tTPSF最大值来评价。通过比较实测荧光信号振幅与模拟值，重新得到荧光基团的浓度。

使用OptiView 2.1软件估测荧光的衰减。软件可以通过LM算法测量荧光强度衰减曲线。该算法适用于一个非线性最小二乘最小化算法来计算的多重指数的荧光衰退。

2.1 脑损伤的组织学评估
在一些实验中，成像结果通过脑组织的组织学平估来确定。成像后，动物被灌注肝素化盐水和10%的福尔马林，然后使用Vibrotome切片，切成25µm厚的断片。邻近的部分都使用苏木精和曙红进行组织化学染色，来鉴定受损区域，或者使用异硫氰酸荧光素（FITC）（1:100；30min）鉴别脑血管，以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）(1 mg/mL; 1 min)进行细胞核染色。H&E-染色的部分使用LCM PixCell IIe显微镜观察并记录相位对比。血脑屏障使用Axiovert 200荧光显微镜(Carl Zeiss, Maple Grove, MN)肉眼观察cy5.5从大脑薄壁组织溢出，使用近红外模式（660到680nm激发滤光片和一个700nm的纵向发射滤光片）。成像过程使用AxioVision LE Rel 4.4软件。

2.2 统计分析
数据显示为±SD荧光强度或荧光的浓度。缺血性和对侧的ROI的统计分析的差异使用单向方差分析，随后通过多样本重复比较或双尾配对样本t检验说明。p值小于0.05被认为差异显著。

3.  结果

3.1 短暂的MCAO后Cy5.5体内成像对比度增强
近红外染料Cy5.5不会穿过完整的血脑屏障体外(数据未显示)或体内(通过实验证实，见图6B)。在循环中染料迅速消除，主要是通过肾脏排泄。已知过渡态的MCAO可以产生BBB，小分子的钆和大分子的白蛋白，分别使用Cy5.5和BSA-Cy5.5为光学标记物，基于示踪组织溢出来定位局部缺血性中风。类似的原理应用于核磁共振成像技术，使用钆增强成像效果。在最初的一系列实验中，60分钟MCAO后，紧接着进行24小时再灌注，因为它会产生可再生的梗塞，影响很大一部分侧纹状体和颅侧区皮层，也会缓和血脑屏障的大分子中断。实验方法见图1A。经过最后的60分钟的MCAO测量所有动物的重新缺血性值，结果统一的减少局部脑血流量产国缺血性区域低于20%。之后重复缺血值rCBF迅速恢复为大约70%，而且在重复灌注时可以保持这个值大约一小时以上（数据位显示）。rCBF值测量值证明实验组的最小变异值（数据未显示）和已报道的同样的缺血性模式的数据相似。成像前Cy5.5静脉内注射15分钟，随后在半球形的ROIs获得两个成像参数FI和Conc并进行分析。（图1 B-D）。FI信号变现出明显的大脑左侧（缺血性）偏侧性（见图1B）；在六个单独的动物的大脑半球缺血的FI平均值为3,580 ± 50 AU，对侧半球为730 ± 35 AU（(p < .01; t-test; each ROI =150 points)；右大脑半球FI值与重新缺血的基线水平相似 (700±25 AU)，在注入Cy5.5的模拟动物中的测量值为 (740±30 AU)。这一结论证实大部分Cy5.5在注入15分钟后在循环中消失。

与其他成像技术不同，时域光学技术可以给出荧光基团的深度和浓度信息，可以进行3D重建和断层成像。三维影像图分别显示有x轴，y轴好z轴的头部位置（见图1C），1毫米厚度的光切面见图1D，在缺血新半球深度为6到9毫米（从大脑侧面顶部测量）时Cy5.5的浓度值最大（图1D）。8-9毫米的光学切片（图1D放大图像）缺血性区域三维扫描点的Cy5.5的浓度测量值要比对侧的高10倍。

图1：动物经过短暂的60分钟MCAO，紧接着进行24小时再灌注并注入Cy5.5（100nmol，成像前15分钟）的头部ROI区域的体内成像图。使用eXplore Optix时域临床前成像仪。A：本实验试验方法图。B：缺血/再灌注前后（I/R）头部ROI荧光强度（FI）的代表图像。C：头部浓度体积测定面重建（分三部分显示，X轴、Y轴和Z轴），在动物头部侧面有3D断层成像。D：Z轴部分（201mm切片）通过头部厚度。头部顶端侧面8—9毫米深度部分的信号最强。是6个动物最具代表性的实验结果。

3.2 Cy5.5溢出的组织学确认
梗塞形成的范围由60分钟MCAO及随后的24小时在灌注在TTC染色脑切片厚度的评价。通过H&E染色进行神经元损害的组织学确认，使用Farber和他的同事们研究的标准，Cy5.5溢出通过荧光显微法评价。在荧光显微镜下大脑部分大致相当于脑区在厚脑切片中描述。如图2B显示，缺血性半球的切片相当于图2A中1,2,3的厚度，表明有典型的神经元坏死，而部分对应厚片4(见图2)出现了类似的侧大脑半球。 邻近部位的复染剂使用导管结合凝集素（绿色）（图2C），cy5.5（红色信号）溢出到大脑薄壁组织扩大到缺血性区域相当于厚片1到3，但是与厚片4不同（图2，A和C）。有趣的是，一些Cy5.5薄壁组织外溢始终观察到对侧半球的切片相当于厚片1（图2C1，白色箭头），甚至在没有组织学证据的神经损伤。血管内残留的Cy5.5荧光，主要在缺血性部位观测到，可能是由于不良的缺血性血管的灌注。

图2：A，经过60分钟大脑中动脉闭塞（MCAO）后24小时大脑切面TTC染色的代表性图像。缺血和脑切片（1-4）对侧25mm部分的组织学（B）和荧光显微镜（C）分析结果，过程见材料和方法部分。使用FITC-番茄血凝素（绿色）和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（蓝色）使大脑血管形象化。Cy5.5溢出的信号（红色）在对侧采用箭头显示。比例尺=10µm。是6个动物最具代表性的实验结果。

3.3 短暂的MCAO后BSA-Cy5.5体内成像对比度增强
为确认60分钟MCAO后BBB渗透性选择的大小，在MCAO后立即静脉注射50mg BSA-Cy5.5，然后动物在1、3、24小时灌注后成像(图3A)。因为BSA-Cy5.5循环的半衰期远长于Cy5.5，只有一个需要注入进行长达24小时的纵向研究。图3表明注入BSA-Cy5.5后，对照组的（上部）和缺血性（下部）头部ROI FI信号的动物。动物经过MCAO后（图3，B和C），三小时后大脑左半球的FI平均信号比右半球增加2.5倍，24小时在灌注后显著的增加（4.5倍）。未缺血的半球有轻微的信号，但是进过24小时再灌注的模拟组相比没有明显的提高（图3D）。由于BSA-Cy5.5血浆半衰期长，在24小时后缺血半球观察的对比反差增强，反应的是大脑积累动力学而不是BBB子啊不同时间点的渗透性位点。

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三维影像图的X轴，Y轴和Z轴表现出头部的切面（图3D）和1毫米的断层成像，两者都显示出在MCAO后24小时BSA-Cy5.5信号左侧半球的明显的单侧化。在光学部分对应于6至7毫米深从头顶剖面(图3E放大的图片)，BSA-Cy5.5的浓度信号完全的偏向左半球，相当于在右半球MCA区域没有检测到信号（图3E，坐标轴描述）。观察到头部剖面后部的信号双向起源于下颌下和肩颈区的腺体和软组织，这里大的MW BSA-Cy5.5长时间存在。

图3：经过60分钟适度的MCAO后，接着进行24小时再灌注并注入50mg BSA-Cy5.5后头部ROI区域有代表性的体内成像图片。A，实验方法图。B，模拟组（上部）和经过MCAO（底部）荧光强度（FI）的典型图像。C，左侧缺血（黑色正方形）和经过MCAO后大脑对侧半球（黑色三角形）的定量分析，以及模拟组动物再灌注左（空心正方形）和右侧半球（空心三角形）。每一个点表示从六个动物中获得的FI值±SD。星号显示左右半球存在显著性差异（(p <0.05)。D，体内头部浓度体积测定面（X、Y、Z）动物头部侧面3D断层成像重建。E，Z轴部分（201mm切片）通过头部厚度。头部顶端侧面6—7毫米深度部分的信号最强。是6个动物最具代表性的实验结果。

3.4 体外大脑成像的体积分析
大脑体外成像的体积测定采用Cy5.5和BSA-Cy5.5荧光浓度信号的比较， 3D重建和光切面。光切面的Cy5.5的浓度信号通过X,Y和Z轴见图4A。缺血的核心区域与梗塞的边缘部位的Cy5.5浓度信号增加四倍（见图4A，Z轴），缺血性核心区域是对侧半球的12.5倍（见图4A)。BSA-Cy5.5浓度增加左大脑半球的平面和三维重建图见图4B和C。对比增强的体积估算采用每一个切片的厚度的倍数增加，Cy5.5和BSA-Cy5.5分别为(71±11 mm3)和(44±7 mm3)。梗塞体积的测量单个动物的经过60分钟的MCAO和24小时的重灌TTC染色为43.61 ± 0.98 mm3，与已报道的文献相似。

与对侧半球观察的组织切面的Cy5.5外渗相比，对侧半球中未检测到BSA-Cy5.5外渗，使用荧光显微方法(数据未显示)。尽管大脑体外的大多数荧光增强的信号测量很可能来自外渗示踪物（薄壁组织），我们不能排除在这些示踪物在分析中残余在血管内。

 
图4：动物经过60分钟MCAO后24小时再灌注并注入Cy5.5（100nmol，成像前15分钟）（A）或BSA-Cy5.5（50µg，成像前24小时），动物体外大脑成像的典型图像（B和C）。通过厚度切片体外大脑（光学断层成像）的Z、X和Y的图像。B，BSA-Cy5.5分布的体积测定面的体外重建的典型图片（X、Y、Z）。C，Z轴部分是通过体外大脑厚度切面显示出左侧半球Cy5.5-BSA 信号完全的偏侧性。是6个动物最具代表性的实验结果。

3.5 瞬息态MCAO的体内成像没有对比增强
鉴于内源荧光团的荧光寿命随组织微环境而改变。随后检测通过瞬息态的MCAO（60分钟后接着进行24小时再灌注）大脑注入是否能被体内时域光学技术检测到。尽管经过MCAO后左半球和右半球的内源FI相同（图5A和表1），MCAO后左侧缺血半球的内源FI的平均值明显（P<0.05）高于对侧半球(图5A和表1)。

同样，缺血半球的荧光寿命的平均值av比再缺血值显著增加（图5A和表1）。经过MCAO后左半球和右半球的归一化衰减曲线分别显示与图5b1和图5b2。在缺血半球衰减缓慢。在缺血半球的大脑体外内源FI和tav值显著提高（见表1）。因此，缺血区域内源FI和tav值和体内和体外的信号参数相同。

图5：A，经过60分钟MCAO，24小时前后头部ROI区域的内源荧光强度（FI）和荧光寿命（t）的代表性图像。B，MCAO前（b1）和MCAO后24小时（b2），大脑左半球（红色）和大脑又半侧（绿色）的标准的时间衰减曲线。分析的像素选择显示在A的红色和绿色的星状图形。C，大脑体外成像有代表性的内源FI和荧光寿命。

表一：经过短暂的左侧MCAO及随后的24小时再注入后前后，体内左右半球ROI的内源荧光强度（FI）和荧光寿命()值。动物在再灌注结束时注入50毫升盐水，注入后15分钟使用 eXplore Optix成像。

	左 FI [AU]            av [ns]		右 FI [AU]             av [ns]
体内 MCAO前 MCAO后	800 ± 20 1180 ± 25*†	1.0 ± 0.1 1.3 ± 0.1*	850 ± 30 930 ± 35	1.0 ± 0.1 0.9 ± 0.1
体外   对照   MCAO后	800 ± 25 1000 ± 20*	0.5 ± 0.1 0.9 ± 0.1*	800 ± 25 800 ± 15	0.5 ± 0.1 0.5 ± 0.1

荧光寿命分析采用双指数函数LM算法。荧光起那个毒FI使用任意单位。av—荧光寿命平均数。具体数值是指去除背景干扰后±SD。n=6组。*表示大脑左右半球p < 0.05 (t-测验)，†表示MCAO前后p < 0.05 (t测验)。

3.6 适度的MCAO后BBB渗透率的纵向评价
为评价时域光学技术在评价经过MCAO后的BBB渗透性的纵向变化的有效性。我们使用短暂的20分钟的MCAO损伤，产生微小的损伤影响平层下结构和白质，这样可以使小动物纵向研究中可以存活长达14天。

因为外溢的Cy5.5经过24小时后从大脑中消除（资料未显示），不留残余的信号，这样可能可以通过重复注入Cy5.5来估计BBB纵向渗透性位点，假如注射间隔要长于24小时（图6A）。对照组的动物血管内皮不渗透Cy5.5（图6B）。浓度/深度信息结合3D重建表明再灌注14天后Cy5.5浓度两侧的变化。24小时时左半球Cy5.5浓度信号表现出偏侧性（图6B）；随后信号早MCAO7天后在左右半球都有增加；MCAO14天后，在模拟组动物的两侧信号基本相同（见图6B）。经过适度的MCAO后Cy5.5浓度信号的定量分析见图6C；缺血半脑的信号明显的高于对侧半球（见图6C）。

     

图6：经过短暂的20分钟左侧MCAO后动物BBB渗透性的纵向分析（使用eXplore Optix）。A，实验方法图。B，同一只动物在MCAO前和MCAO后不同时间（1,7和14天）头部ROI部位体内成像的典型图像。小鼠成像15分钟前注入100 nmol Cy5.5，模拟组注入Cy5.5作为对照。C，大脑左半球缺血（实心正方形）和右半球（实心三角形）以及模拟组动物（空心正方形）的平均荧光强度的定量分析。

每一个点表示从六个动物大脑半球ROI获得的平均FI±SD。*左右半球有显著性差异(p < 0.05);†表示缺血前值有显著性差异（(p <0.05;ANOVA)

4.  讨论

本研究首次时使用时域光学技术用于非入侵体内评价实验进程的定位、过程和分辨率。这种技术，与连续波和基于频域范围的光学成像技术,该技术可以检测光学浓度和组织深度，以及测量外源或内源荧光团的荧光寿命。尽管它缺少空间分辨率，但是该技术的灵敏度优于MRI小动物成像系统，能够检测到标记物浓度的微小变化。体内多光子显微技术，使用近红外波激发而且允许亚微米分辨率的体内成像及大脑表面一下几百微深度，最近，可用于研究脑学系统。然而，尽管高分辨率，体内多光子显微本质上仍然是入侵技术，需要打开脑的，因此适用于分析空间有限的脑区域，不适用于疾病的前瞻性研究。这项研究表明时域光学成像技术能探测脑梗塞损伤的实验模型,并以其灵敏度高,能提供信息和动态范围的血脑屏障干扰的一种非侵入性、卒中后的前瞻性的方法。

大脑毛细管内皮生理情况下可以选择性注入营养,但阻止大多数循环的化合物,包括治疗药物和造影剂到达大脑。血脑屏障干扰由炎症性疾病,中风,大脑外伤性脑损伤,或脑部肿瘤被剥削传递显像剂如钆脑和生产对比度增强脑部病变及周围描绘脑水肿。然而,令人惊讶地是，很少知道缺血性脑损伤的过程中中断期间血脑屏障时间动力学、空间分布、尺寸的选择性。

目前一些文献对于方法上的共识是转化研究，在这一领域叫做“时间过程量化的障碍的分子分解到不同尺寸的不同类型的神经创伤后,作为一种研究优先”。本研究报道了一种新的体内成像的方法，应用于BBB渗透性检测和缺血注入；利用这种方法我们可以确定在严重的MCAO后血脑屏障紊乱的大小选择性，以及适度的MCAO后血脑屏障紊乱的动力学。

本研究中首次描述了利用时域光学技术，清楚的证明了在60分钟MCAO后24小时，不论是小的还是大的MW示踪剂BBB都出现在缺血大脑区域；这能够可靠地描绘出在荧光强度增强和提高光学探头浓度。体内采用荧光显微镜观测显示一个Cy5.5溢出。

通过比较Cy5.5和BSA-Cy5.5表明MCAO后24小时缺血核心区域的两种示踪剂分子量大小对BBB没有影响。然而，3D重建分析证实了与BSA-Cy5.5相比，在半侧区，特别是接近大脑中心区域的Cy5.5浓度信号明显的增强了。这一观察结果表明，MCAO后，大的MW示踪剂BBB渗透性被TTC染色限定了区域，然而小的MW示踪剂与大的及TTC划分界限的梗死体积相比，有更广泛的空间分布。再灌注后体外大脑成像的y5.5和BSA-Cy5.5增强的区域略少于体内，表明在体内有从头颅和表明的内散色。显微镜下,Cy5.5外溢也持续证实了在侧前方额部分。

择性血脑屏障干扰变化的空间分布和大小的选择已经早期的风研究中提出。使用放射性同位素示踪物研究大树的结果表明，在短暂的全脑球缺血或经过两小时中心缺血后24小时，蔗糖(342 Da)的转换系数比大分子的菊粉(5,000 Da)高三倍。最近的一项研究显示大树精3小时MCAO后24小时钆喷酸莆氨(Gd-DTPA) (550 Da)与BSA- Gd-DTPA(68kDa)的多核磁共振谱分布区域增强。Gd-BSA-EB (Evan’s blue)增加区域与Gd-DTPA增加区的Tl-sat的同步变化大，这表明，血脑屏障损伤的一个主要因素是对比增强的不同。

尽管根据本研究中的数据判断是引人注意的并且可以推断使用小的和大的MW示踪剂的BBB替代半影成像生物标记物的空间分布不同。类似的磁共振成像分析的扩散灌注错配模型，这些研究的缺点会阻碍确切的结论。与Nagaraja和他的同事的研究相比，本研究中使用Cy5.5和BSA-Cy5.5早分组的动物中，不平等交付的两个造影剂由于局部灌注差异不大可能给予最少量的interanimal变异性rCBF测量评价。

BBB渗透性的时间动力学已经在脑缺血实验模型中描述。例如，瞬态全脑缺血的特点是血脑屏障的两个阶段的开放，顶峰在1小时和24小时，在重灌注后6小时向后倾斜。每一个血脑屏障紊乱的事件伴随着脑血管蛋白表达的明显变化：离子转运和能量驱动泵在一小时损失，而且炎症的和血管生成蛋白在24小时表达量增加。经过短暂的和适度的MCAO后BBB紊乱的时间模式，使用纵向光学成像的研究表明两个阶段全脑缺血模式表现出惊人的相似之处，虽然持续时间较长。24小时时同过测量不同深度的荧光浓度表现出身体同侧Cy5.5对比增强，3天的停滞期，经过MCAO7天后出现二次增长。有趣的是，本研究同样还发现在对侧半球的Cy5.5 BBB渗透性明显增加；Cy5.5血脑屏障干扰,在ipsi和侧半球解决经过适度的MCAO14天时。文献研究在适度的MCAO后持续很长一段时间的BBB渗透性变化缺乏。然而, 通常在温和的外伤性脑损伤和与神经元的活动后持续血脑屏障(多年的)在病人中很常见。Miyashita和他的同事对小鼠进过2分钟MCAO进行的全面的研究“进过处理后不论是梗塞面积还是身体同侧的神经胶质过多症都是至少在7天后化脓或增加，以及PECAM-1-positive细胞的增加，表明处理后7天和56天之间毛细管密度增加。经过处理后观察Cy5.5使用体内成像，这些改变可能造成长期血脑屏障干扰。

成像技术提供“组织危险”中风治疗前后的信息，现在尝试用再灌祝贺扩散MRI结合，有利于急性卒中的管理。内源荧光寿命-是一个潜在的新的成像参数，它可以提供体内组织位点的额外的信息，因为他对组织微环境包括组织pH，组织缺氧或缺血敏感度高。有趣的是，在脑缺血区域与模拟组动物或对侧半球的相比内源的FI和都有明显的增加，允许缺血性中风的可靠检测，甚至在缺乏对照注入的情况下。这些变化的原因值得深思；尽管可能由于血脑屏障干扰（使用对比增强的方法）会引起脑水肿，缺血或损坏的组织可能会引起代谢变化。在我们最近的肾缺血/再灌注的研究中，内源性t对指数衰减分析可以可靠的鉴别体内肾脏脑缺血。更好的理解微环境的小变化，引起内源FI和变化，在今后必需考虑到作为代谢组织的分子成像指示物。时间分辨扩散光层析成像最近发现, 人类诊断的生物学组织提供解剖学和功能信息。内生光组织成像参数的非侵成像，包括t，目前应用于乳腺癌的临床诊断。

本研究中中风的体内时域光学成像的应用已经做了描述，可以促进新成像技术的发展和替代监控中风发生、持续和恢复的标记物。在缺血前后脑血管损伤的程度是脑水肿、出血性变换,中风患者的结果的积极的指标。非侵评价缺血性中风的持续和分辨率的选择性血脑屏障通透性的大小，可以有效的替代中风严重性和治疗的转换后效率的指示物。

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