基于近红外荧光检测技术的In-Cell Western™ Assay的应用与方法学优势[新品推荐]

    Western Blot是对蛋白质进行分析的*常用的技术之一，在RNAi筛选和药物筛选磷酸化分析中往往涉及到高通量的Western Blot操作。这样的实验通常是对2种以上的蛋白质进行检测（内参蛋白与目的蛋白，总蛋白与磷酸化蛋白），化学发光法需要Strip，且定量不准确，膜上操作步骤繁琐，涉及到细胞裂解、电泳、转膜等诸多环节。In-Cell Western™ Assay则直接将微孔板内的细胞经过甲醛固定、透化、孵育一抗二抗并洗涤等简单步骤，*后直接将微孔板扫描成像。In-Cell Western的相对灵敏度同于或好于膜上的Western，由于省去了多个手动步骤而减少了实验误差，使得Intra-Assay和Inter-Assay的重复性都大为提升。

一、In-Cell Western原理、实验流程示意图

    用微孔板培养细胞后直接将板内的细胞用甲醛固定、透化后孵育一抗二抗，洗涤后直接将微孔板扫描成像。

二、In-Cell Western相对膜上Western的操作步骤大为简化

    In-Cell Western用红外标记的二抗直接标记细胞内的蛋白，可定量每个微孔内的总荧光量。在In-Cell Western分析中，省略了细胞裂解物的制备，制胶，电泳以及转膜等这些费时又易于产生错误的步骤，避免了细胞裂解过程的不稳定性和人工产物的干扰，并且可同时进行多个样品的检测。双色检测使定量更为精确，同时由于一般的酶检测方法针对的是纯化过的蛋白，因而这种细胞内的检测结果能提供更多更准确的信息量。

	膜上Western	In-Cell Western
细胞培养	√	√
细胞刺激	√	√
固定和透化		√
细胞裂解	√
上样	√
电泳	√
转膜	√
孵育一抗	√	√
洗涤一抗	√	√
孵育二抗	√	√
洗涤二抗	√	√
成像	√	√
总共所需时间	9-12h	7-8h
通量	12 sample/Gel	96或384/Plate

三、为什么选择双色近红外荧光技术？

    相对于化学发光法，荧光信号的线性范围更加宽广，定量准确，而一般的荧光染料不能直接用于检测膜上的蛋白或者塑料培养皿中的蛋白，因为它们的激发和检测波长位于可见光谱区，从而容易产生高背景荧光干扰。近红外荧光（670-1100 nm）染料在长波下它的背景荧光很低，具有很好的信噪比。Odyssey红外激光检测系统利用这一原理，系统同时发出两种红外波长的激光进行检测，其内部含有两个激光二极管，分别产生两种波长的激光（680nm和780nm），另外还有两个激光检测器，分别检测720nm和820nm波长的荧光信号，该系统可以用于检测膜上和微孔板上的蛋白或核酸。在此基础上，双色荧光则可同时检测2种以上的靶蛋白，尤其适用于磷酸化分析。除此之外，用红外染料标记的抗体，在不同的波长下可一次同时检测膜或微孔板上的多种蛋白分子，并由于荧光信号强度和蛋白的丰度或含量具有很好的线形相关性，它不同于化学发光法是一种基于酶促反应，其检测易受到诸多因素影响而导致定量不准确，因此可以进行准确的定量。这是化学发光法和同位素技术所无法完成的。

四、双色In-Cell Western分析

 
    将A431细胞接种于96孔板上培养，细胞用100 ng/ml的EGF处理15分钟。处理完毕后，将细胞用4%的甲醛/PBS室温固定20分钟，再用0.1% Triton X-100/PBS洗涤3次。兔抗和鼠抗分别作用于总ERK和磷酸化的EKR，羊抗兔抗体用Alexa Fluor® 680标记，羊抗鼠抗体用IRDye 800标记，因而总ERK（红色）和磷酸化的ERK（绿色）被直观的显示出来。以总蛋白作为内参，对ERK蛋白的磷酸化进行定量分析。

五、小结

    In-Cell Western相对于膜上Western而言，省去了细胞裂解、电泳、转膜等繁琐步骤，降低了引入实验误差的风险，故而其Intra-Assay和Inter-Assay的重复性均好于膜上的Western，如此提高了实验数据的可比性和可信度，是高通量分析蛋白表达时的理想方法。

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