Nature子刊:首个电镜版GFP问世

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2012年10月25日 来源:生物通

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  日前,麻省理工的化学家们开发出了类似GFP的电镜标记,利用这一新技术科学家们就可以在电镜下观察标记蛋白,达到前所未有的清晰度。该研究于十月二十一日提前发表在Nature Biotechnology杂志的网站上。

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生物通报道:绿色荧光蛋白GFP曾给分子生物学领域带来了一场革命,科学家们用GFP标记细胞内的特定蛋白,就能够通过荧光显微镜轻松的进行识别和定位。但GFP无法用于电镜,而电镜的分辨率可比荧光显微镜高多了。

日前,麻省理工的化学家们就开发出了类似GFP的电镜标记,利用这一新技术科学家们可以在电镜下观察标记的蛋白,达到前所未有的清晰度。该研究于十月二十一日提前发表在Nature Biotechnology杂志的网站上。研究人员相信,这一技术将帮助科学家们更深入的了解蛋白。

被用于电镜成像的这种新标记被称为APEX,它其实与天然蛋白很相近。我们都知道,辣根过氧化物酶HRP是一种常用标记,但它只在细胞中部分区域起作用。而那些能够在整个细胞起作用的标记技术一般很难用于电镜,因为这些标记通常需要有光照在样本上。

研究人员选择从类似HRP的抗坏血酸过氧化物酶APX入手,因为APX比HRP作用范围更广能够在细胞质中起作用。HRPAPX都属于过氧化物酶类,每种过氧化物酶都有不同的目标,HRP的一个主要目标就是DABDAB氧化时就能够被电镜检测到。研究人员对APX进行了遗传学改造(即APEX)使其也能够作用于DAB

研究人员将APEX基因与目标蛋白的基因连在一起,并将这个小DNA环转入活细胞。此后细胞就会合成携带APEX标记的蛋白。随后研究人员在固定细胞时加入DAB,固定是电镜成像前的必须步骤。当APEX蛋白氧化DAB时,研究人员就能够通过电镜检测,确定目标蛋白的精确定位。

去年有两个研究团队发现了一种钙离子通道蛋白,他们都认同这一蛋白位于线粒体中,但对于该蛋白的精确定位和定向却各持不同看法。MIT的研究者们用他们的新技术来解决这一问题,以此证实自己新技术的实用性。在新标记和电镜的帮助下,他们发现这种钙离子通道蛋白位于线粒体内膜,并且朝向线粒体内部基质。研究团队还成功利用新标记技术对细胞核、内质网以及细胞质中的蛋白进行了检测。

哈佛大学分子和细胞生物学教授Joshua Sanes正在与该研究团队合作,利用新标记技术进行神经元的研究。目前,MIT的研究人员们正在给自己的新成像技术申请专利,他们还将进一步提高APEX分子的稳定性并改善其功能。

(生物通编辑:叶予)

生物通推荐原文摘要:

Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy

Electron microscopy (EM) is the standard method for imaging cellular structures with nanometer resolution, but existing genetic tags are inactive in most cellular compartments1 or require light and can be difficult to use2. Here we report the development of 'APEX', a genetically encodable EM tag that is active in all cellular compartments and does not require light. APEX is a monomeric 28-kDa peroxidase that withstands strong EM fixation to give excellent ultrastructural preservation. We demonstrate the utility of APEX for high-resolution EM imaging of a variety of mammalian organelles and specific proteins using a simple and robust labeling procedure. We also fused APEX to the N or C terminus of the mitochondrial calcium uniporter (MCU), a recently identified channel whose topology is disputed3, 4. These fusions give EM contrast exclusively in the mitochondrial matrix, suggesting that both the N and C termini of MCU face the matrix. Because APEX staining is not dependent on light activation, APEX should make EM imaging of any cellular protein straightforward, regardless of the size or thickness of the specimen.

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