专家经验谈:活病毒成像指南

【字体: 时间:2012年10月31日 来源:生物通

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  麻雀虽小五脏俱全,病毒虽然小但其结构和功能是很复杂的。荧光成像技术是直接观察病毒的一种非介入性途径,要用好这种技术也有许多需要注意的地方,The Scientist杂志就此请教了多位专家,为您奉上在活细胞中观察病毒行为的一份指南。

生物通报道:对于大多数生物学过程来说,所见即所得。由于病毒在感染性疾病中的作用,许多生物学家希望能够实时观察病毒的活动。要观察病毒感染细胞和病毒装配的过程,荧光成像是少数几种非介入性的途径之一。进行这样的研究需要带灵敏相机的高质量显微镜,能支持每秒多次成像。还需要确认荧光标签和实验设置不会干扰到我们想要研究的目标。

麻雀虽小五脏俱全,病毒虽然小但其结构和功能是很复杂的。荧光成像技术是直接观察病毒的非介入性途径,不过我们也需要注意到一些问题,Crucell公司的资深科学家Börries Brandenburg介绍道,“你需要对自己的病毒足够了解”。病毒虽小,但也是很有组织性的系统。病毒实验需要精心设计,才能确保所观察到的荧光与您想要研究的生物过程有关。

The Scientist杂志就此请教了多位专家,为您奉上在活细胞中观察病毒行为的一份指南。

如何选择标记

做标记是追踪病毒的第一步,成功的标记需要兼顾病毒和所要观察的目标。病毒一般从25nm(如小核糖核酸病毒picornaviruses)到一微米长(如副粘液病毒paramyxoviruses)。在病毒基因组中插入一个编码荧光蛋白的基因,是让病毒发光的久经考验的方法。对于较大的病毒(如400 nm的牛痘病毒),人们一般选择插入绿色荧光蛋白GFP或红色荧光蛋白RFP等传统荧光标签,这样并不会扰乱病毒的结构和功能。而对于平均直径只有100nm的流感病毒就很难用传统荧光蛋白进行标记,因为这些蛋白的大小足以影响病毒的正常功能。

对于这样的小病毒,需要使用荧光小分子通过化学方式标记病毒中的脂质、蛋白或者糖类。这样的标记与特定的功能性分子结合,由于这种结合是非特异性的,所以在使用的时候无法确切了解到我们标记的是什么分子。不过也有给目标分子特异性添加化学标签的新方法可供选择。Whitehead研究所的Hidde Ploegh及其同事就开发了一种位点特异性的标记方法,使用能够识别特定氨基酸序列的细菌酶来标记蛋白,他们目前就在利用这种方法检测流感病毒颗粒。在PLoS Pathogens上发表的这项研究中,Ploegh及其同事对一种细菌的酶进行了改造,使其能够识别两个流感衣壳蛋白。并且使用标准多肽合成仪器给短肽加上了荧光标签。这种方法能够特异性识别带有识别序列的蛋白。他们这项研究所用的都是现成试剂、固相多肽合成系统以方便获得的酶,这些工具对于大多数生化学家和细胞生物学家来说都不难获取。

还有一个基本的问题,我们该用多少荧光标记呢?Brandenburg介绍道,总的来说在不影响病毒生物学过程的情况下当然是标签用得越多越好。随着时间推移曝光会漂白荧光染料,因此荧光标记用得越多,你就能赶在染料褪色前观察得越久。不过这里也有许多需要考虑的因素,如果你选择将目标蛋白与荧光标签结合起来形成融合蛋白,那么就要确保标记蛋白够小折叠够快。

不同的标记技术有不同的优势。如果用GFP标记病毒中的蛋白,它能在病毒装配时表达,你就可以在实验中利用它来追踪特定目标分子。我们也可以使用化学标记在特定的时间点标记病毒,这对于构建脉冲示踪实验pulse-chase非常有用,可以标记特定时间点出现在病毒上的分子并进行实时跟踪。这样的研究可以使人们在病毒生命周期中监控这些分子的改变。

发光的就是病毒么?

在标记了目标病毒之后需要进行一系列预实验,我们得确认标记是否成功,以及我们是否能够分辨单个病毒。由于可见荧光点通常比实际病毒要大,所以我们无法立刻判断自己观察的是否就是单个的病毒颗粒。要了解我们所观察的样本,简单的光漂白实验就是第一步。进行光漂白,我们就可以观察到样本中各光点荧光褪色的速率。这样的速率越平均就说明样本越均一,在成功标记的样本中“大多数颗粒应该行为相似,”Brandenburg说。

根据不同病毒的特性,我们也许需要改变鉴定程序。例如,纽约洛克菲勒大学的Sanford Simon及其同事在进行HIV和丙肝研究时,就采取了不同的标准来区分完整病毒和其他荧光体。一开始,他们就发现自己遇到了挑战,“因为之前还没人观察过单个病毒的组装,我们并不清楚应该在显微镜下找什么,”他说, “我们甚至不知道装配要花几秒钟还是几分钟。”

他们用GFP标记了HIV的结构蛋白Gag,并建立了四个针对病毒装配的标准,他们发表在Nature上的论文详细描述了这些标准。首先,他们观察了样本中光漂白的分布。随后他们分析了颗粒重获荧光的情况,完整的病毒重新发荧光的过程较为缓慢。接着他们通过荧光共振能量转移FRET检测荧光颗粒中蛋白的组织形式,完整病毒中的蛋白应该很紧密。最后,他们调节了样本的pH值并用对pH敏感的蛋白进行监控,来确定病毒颗粒是否已经完全脱离了宿主细胞。

除此以外,我们可能还需要考虑到自己病毒的一些特性,不过Simon强调说关键是要设定明确的标准,以便日后可以重复实验。

除了病毒还能看到什么?

病毒成像实验不仅能够检测病毒的结构和行为,也为人们提供了疾病研究的窗口。

我们能够利用标记了的病毒来跟踪感染过程中的基因活动。西奈山医学院的Adolfo García-Sastre及其同事就通过荧光标记技术来研究小鼠感染流感的模式,这项研究发表在美国国家科学院院刊PNAS上。他们构建了编码GFP的基因工程病毒,以便追踪被感染的细胞。这可没有听起来那么简单,因为病毒很小,这样的标记很难不影响到病毒的行为。研究人员标记了一个影响病毒毒力的蛋白,并跟踪了该蛋白在小鼠肺部的表达,由此他们分析了抗病毒药物oseltamivir所引起的变化。

García-Sastre认为成像工具可以帮人们解决以下问题:什么类型的细胞受到了感染,什么类型的细胞获取了抗原,这些抗原何时消失,感染是如何传播的等等。

深入病毒表层

荧光成像并不是跟踪观察病毒活性的唯一途径。如果您感兴趣的是病毒的结构或者病毒中较慢的生物过程,那么原子力学显微镜AFM也是一个好帮手,不过这一技术还未得到生物学家的充分利用。AFM在扫描样本时实时生成图像,这种方法检测的是病毒的表面,要深入病毒内部就需要用试剂一层层剥开病毒,由此获得的一系列图像来揭示病毒内部的精细结构。

AFM的分辨率约为10 Å,这使其观察小病毒的能力受到限制。不过对于较大病毒的成像来说,AFM非常好用,因为这种方法不需要进行结晶、染色和固定。AFM可以捕捉到活病毒中较慢的结构改变,如果您需要追踪快速发生的生物过程,仍需选用荧光显微镜。

一般来说AFM的价格在150,000200,000美金之间,AFM的操作间需要保持安静并且做好防震。总的来说这一技术很容易上手,不过要得到高质量的图像还需要操作者投入大量时间累积经验。

Sarah Webb撰写/叶予编译)

生物通推荐原文节选:

“Alive” and In Focus

For almost any biological process, seeing is believing. Because of the role viruses play in infectious disease, many biologists would like to observe them doing their thing in real time. Fluorescence imaging provides one of the few noninvasive ways to observe how viruses transport their contents into a cell and how new viruses are assembled. Such studies require high-quality microscopes with sensitive cameras that can shoot multiple frames per second. As with cells, researchers have to make sure that the position of fluorescent labels and the experimental setup do not interfere with the behavior of the system that they are studying.

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