攻克多重PCR之难(上篇)

【字体: 时间:2012年11月05日 来源:生物通

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  多重PCR能够在提高通量的同时节省样品降低成本,它需要耗费更多的时间和精力,同时也会给用户回报更丰富的数据。本文介绍了一些实验技巧和商业化工具,希望能帮您轻松获得好结果。

生物通报道:多重PCR能够在提高通量的同时节省样品降低成本,它需要耗费更多的时间和精力,同时也会给用户回报更丰富的数据。本文介绍了一些实验技巧和商业化工具,希望能帮您轻松获得好结果。

PCR的重要性毋庸赘述,这一诺贝尔获奖技术的普及带动了现代基因组学、鉴定技术、医疗诊断等领域的发展。如今,PCR几乎是每个实验室必备的通用技术,不过要跑好一个PCR也并非那么简单,由于PCR反应很灵敏,PCR的效果很容易受到污染和脱靶效应的影响。我们在设计PCR实验时须得将引物设计、反应条件和酶的选择一一考虑周全。这一点在多重PCR中尤为明显,因为多重PCR需要在一个管中同时检测多个目标(通常二至五个)。多重PCR应用也很广泛,可以用来做基因表达分析、SNP分型、STR分型等鉴定以及病原菌检测等等。

多重PCR的反应数相对较少,所消耗的试剂也较少,是一个颇为经济的选择。人们往往选用多重PCR来处理临床样本等珍贵样本,或者用来增加实验通量,每个样本所需的孔少了,那么一个微孔板自然就能容纳更多的样本。

多重PCR的挑战

传统PCR反应体系包括模板DNA、两个扩增引物、酶和缓冲液,一般最后通过凝胶电泳来检测所得的扩增产物。定量PCR除上述元素之外,还需要荧光探针以便检测反应的进行,不过就不需要进行凝胶电泳了。

从一般PCR到多重PCR,其实验设计的难度也随之翻倍。如果说扩增一个片段需要三条引物,那么两个片段就需要六条,三个片段需要九条,以此类推。这些引物既不能互相结合,也不能与模板DNA上目标片段以外的区域结合。此外,我们还要考虑同时检测不同的扩增子,要么就使不同扩增子大小不一以便凝胶电泳,要么就让它们带上不同荧光染料以便区分。更麻烦的是,多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源,其结果是高丰度模板能够被很容易的检测到,而低丰度的模板彻底沦为背景。

上述困难都是进行多重PCR的绊脚石,“大多数人都嫌太麻烦了,”Life Tech的资深科学家Jonathan Wang说“有许多客户对多重PCR感兴趣,但遇到这些麻烦之后,他们都选择了放弃,”安捷伦公司的产品经理Laura Mason补充道。

实验设计小tips

其实假如咱们迎难而上,还是有许多工具和小窍门可以帮得上忙的。NEB的资深科学家Nicole Nichols为正在设计多重PCR反应的研究者们推荐了以下五条基本原则。

原则一A:引物设计

“引物设计这一步是没法跳过的,” Nichols说。“从一开始就好好注意细节,最终将能为你节省很多优化时间。”

她推荐引物设计得比一般稍长一点(24–35 bases),解链温度稍高一点(65 °C以上),并且GC含量控制在50–60%。当然除此以外,PCR引物设计的标准规则是肯定要遵守的:保持几对引物解链温度相似、避免互补序列、避免3’端出现超过3个连续的GC,以及以及验证、验证、再验证。

多重定量PCR不能用SYBR Green等插入染料,探针法是唯一的选择,例如Life Tech公司的TaqMan®探针或者IDT公司的PrimeTime® 探针。Bio-Rad公司的经理Keith Cockrum建议将这些探针的解链温度设计得比扩增引物的高7–8 °C“我们要让探针先退火,”他解释说,要不然序列就会在没有探针的情况下进行扩增,他将这种无法检测到的扩增反应称为“endogenous PCR”。“这是我们想要的特异性PCR反应,我们只是无法检测到其发光,”他解释道。

原则一B:引物验证

引物验证必不可少的步骤,Cockrum建议,首先将每对引物分别在模板上进行测试,这里的模板指对照样本,例如安捷伦公司的QPCR Reference Total RNA。可用SYBR Green熔解曲线分析引物对是否扩增出单一产物。另外还要引入温度梯度,以确定所有引物都能起作用的温度范围。如果有一对引物不能与其他引物一同起作用,她建议直接放弃这对引物重新开始设计,“放弃并重新设计其实比不断优化要好的多。”

如果要做多重定量PCRCockrum建议先在单重反应中测试探针,用一系列稀释度来确定每个探针的动态区域。最后再把所有元素组合到一起,确保各自的特异性、敏感性、动态区域等没有受到影响。“如果将以上都进行了论证,你就会拥有一个非常棒的多重PCR实验,”Cockrum说。

原则二:引物浓度

Nichols推荐的第二项原则是,保证每个引物浓度都低于单重PCR中的浓度,否则“反应中的总引物浓度会就会太高”。传统PCR反应中引物浓度为0.2 μM,那么我们可以试试0.15 μM(引物浓度范围通常在0.05 μM0.4 μM之间)。

(下接:攻克多重 PCR之难下篇 

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