眼见为实的电镜测序技术

生物通报道：此前科学家们曾提出，基于电子显微镜的第三代DNA测序技术将能够得到超常的读长。今年有两项研究分别展示了这一理论的实用性，使电镜测序成为来年备受期待的新测序方法。

近年来，第二代测序技术得到了长足发展，而第三代测序技术也逐步商业化走入寻常百姓家，例如Pacific BioSciences和Helicos的单分子合成平台。不过，尽管这些技术都在测序通量和测序成本上实现了实质性突破，但对于高等真核生物（尤其是植物）DNA串联重复区域中的一些长重复序列而言，目前的测序读长还是不够，使人们难以对这些基因组区域进行可靠测序。

研究显示，以纳米孔为基础的第三代测序技术可以使测序读长达到megabases（Mb）级甚至更长，该技术被认为会在不久的将来进入市场。基于电子显微镜的第三代DNA测序方法也能够达到类似的读长，近期发表的两篇文章就展示了这一技术的巨大应用潜力，电镜测序绝对是2013年最值得关注的新测序技术之一。

利用电子显微镜EM直接读取DNA序列，这一概念并不新鲜但人们却一直没有实现这一技术。这是因为DNA四种碱基之间只有几个轻原子的差异，使人们很难通过电镜进行区分。用于增加透射电镜样本对比度的标准技术，被证明无法提供足够的对比度来区分DNA序列的差异。

用重原子对DNA 进行化学标记以提供区分碱基所需的对比度，这被认为是最值得一试的方法，不过人们此前的种种尝试都未能成功。Bell等人在研究中利用DNA聚合酶在DNA合成时编入了重金属标记的碱基（汞标记的dUTP）。在标记后，DNA被固定在一个薄薄的支持物上，通过DNA分子梳平行地获得分开且拉直了的单个DNA分子。随后研究人员使用环形暗场扫描透射电子显微镜对标记了的DNA进行成像，成功读取了3.2 kb DNA合成片段和7.2 kb病毒基因组中被标记的碱基，展现了电镜测序理论的实用性。研究者们正在进一步改进方法以识别更多的碱基类型，减少标记损失并读取更长的DNA片段。希望2013年这一新型测序技术，能够帮助人们大大超越现有测序读长。

在Bell的文章发表之后，Mankos及其同事也公布了自己的研究，他们通过另一种电镜进行测序，研究显示这一技术比Bell的方法更具优势。Mankos等人并未使用透射电镜TEM，而是采用了低能电子显微镜LEEM，这是一种高灵敏度的表面成像技术，能够得到单个原子层面的高对比度图像。理论上，使用改良版的LEEM可以直接在天然DNA中获得足够的对比度来区分不同碱基。这将是一大重要进步，因为人们将不再需要绞尽脑汁地对DNA样本进行标记，可以直接测序天然DNA。此外这一技术还有一个好处，与高分辨率TEM所需的高能电子相比，LEEM的低能电子不会对DNA样本产生可能引起错读的放射性损伤。

Mankos等研究人员提出的方法是，使DNA在分子梳上拉长，然后在对比度足以区分碱基的情况下进行LEEM成像。他们在初步实验中对大量DNA聚合物样本进行了研究，研究中的对比度足以区分DNA样本与背景，而且研究显示电子能量的微小变化会对DNA对比度产生重要影响。研究人员希望通过新设计的LEEM（单色、相差校正、双光束LEEM）来拓展他们的初步成果，获得能够区分DNA链中不同碱基的对比度。如果这一成果能够在2013年实现，将成为该领域中的重要里程碑。

参考文献：

1. Bell DC, Thomas WK, Murtagh KM, Dionne CA, Graham AC, Anderson JE, Glover WR. 2012. DNA Base Identification by Electron Microscopy. Microsc Microanal. 18(5):1049-53.

2. Mankos, M, Shadman, K, N'Diaye, AT, Schmid, AK , Persson, HHJ, Davis, RW. 2012. Progress toward an aberration-corrected low energy electron microscope for DNA sequencing and surface analysis. J. Vac. Sci. Technol. B. 30(6): 06F402 - 06F402-12.

（生物通编辑：叶予）

生物通推荐原文：

Sequencing: Seeing is Believing

The previously proposed third-generation method of electron microscope-based DNA sequencing would have exceptionally long read lengths and has shown enough promise in two recently published proof-of-principle papers to be named as our sequencing method to watch for 2013.