灵活巧用MiSeq在农业基因组学[创新技巧]

小巧经济的MiSeq系统可在数小时内带来新一代测序结果，而不必花费数周，为农业基因组学研究中毛细管电泳提供一种更高通量的替代。相比毛细管电泳可实现更简化的流程和更快的数据分析，一台仪器可实现小到中型基因组的De Novo测序和重测序，血统验证，RAD-Seq，转基因检测……

简介

农业基因组学研究人员在我们理解的植物和动物学领域已经取得了重大突破——提高了作物产量，并改善了畜牧养殖。许多重要动植物的全基因组序列都已产生，如玉米、小麦、棉花、牛（奶牛和肉牛）和鸡，（有效）支持了研究发展以满足世界对食品、饲料、纤维及燃料的需求。尽管全基因组测序是在新一代测序仪上开展的，但许多其他的农业基因组学测序应用通常仍主要依靠毛细管电泳技术（CE）开展，如克隆检查、扩增子测序和定向转录本测序。毛细管电泳技术已有50多年的历史，在80年代首次用于DNA分析，但流程冗长复杂，需要几个星期才能产生数据。MiSeq® 系统有更快的周转时间和简化的流程，对于小到中型基因组、RNA测序和表观遗传学研究而言，是开展de novo测序和重测序应用的一种更经济高效的替代。

相比毛细管电泳 更简化的流程和更快的数据分析

MiSeq系统提供了第一个端对端的测序方案，将簇生成、扩增、测序和数据分析整合到一台仪器中。它体积小巧（大约只有两平方英尺），可轻松放入实验室中。MiSeq系统采用Illumina的边合成边测序技术，这也是最广泛使用、久经考验的新一代测序原理，目前已有2000多篇论文发表。与Illumina其他的测序仪一样，MiSeq系统也是由TruSeq® 技术所推动，带来了最高的数据完整性，以及最高产量的无错误读取和最多的高于Q30碱基检出。

MiSeq系统特有增强的液流结构，可让试剂循环时间减少5倍，实现在数小时内提供结果，而不是毛细管电泳所需的数周。制备测序文库仅需90分钟，而克隆扩增和测序最快可在4.5小时内完成。在集成的仪器计算机上，从经质量评分的碱基检出到变异体检出和比对，数据分析可在2小时内完成，而无需用户干预。数据可通过Illumina安全的云端资源BaseSpace™来储存、分析和共享，实现空前的合作、访问和安全性。这与毛细管电泳的数据分析能力形成了鲜明强烈的对比，后者不仅增加了操作成本，还对大部分农业基因组学研究小组的人才资源造成压力。

Miseq的流程

特别适合各种农业基因组学测序应用

尽管个子小巧，MiSeq却是一台强大的测序仪，能够开展各种要求严谨苛刻的测序应用，如小型基因组de novo测序，分析基因组中不连续部分的定向测序，阐释基因和蛋白功能的RNA测序，研究短的核苷酸序列在调控发育中所起作用的microRNA测序，以及确定植物和动物发育中DNA甲基化作用的表观遗传学研究。MiSeq性能的不断增强将扩展这些应用，囊括更大型物种的重测序，并支持更高覆盖度的小型基因组测序。更重要的是，MiSeq系统的高精确性、简单流程和极少的手工操作时间将让它成为切实可行的毛细管电泳替代，可用于开展有价值的农业基因组学应用，包括：

文库质量控制

在测序之前验证核酸文库是一个重要的质量控制步骤，可确保下游数据的价值。质量差的文库会破坏大规模测序的成功，并导致昂贵且耗时的重复实验。MiSeq系统能利用2×25 bp测序开展一个前端（front-end）文库检查，从而让研究人员了解覆盖的均一度、插入片段大小、多样性以及文库的GC含量。

克隆检查

MiSeq能够对用于克隆DNA的质粒构建开展快速分析。在不到一天的时间内，质粒重组子可被测序，验证DNA插入片段的存在和完整性。

小到中型基因组的De Novo测序和重测序

在一个工作日内，MiSeq系统能够对小型基因组（<20 Mb）——如病原体和一些植物——完成精确测序。例如，MiSeq在8小时内（40分钟手工操作时间）对5.2 Mb的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）基因组进行了重测序，产生了175 Mb数据，与ATCC10987比对，错配率仅为0.06%。540万个读取捕获了蜡样芽孢杆菌基因组的98%以上，平均覆盖度为30倍。

MiSeq系统还是开展小型基因组de novo测序的经济高效选择。2.8 Mb的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的de novo测序为MiSeq系统的速度和准确性提供了一个很好的例证。项目在22.5小时内完成（手工操作时间不到3小时），并产生了2.78 Mb的de novo装配，其中N50为72.9 kb，最大contig为247 kb。读取与2.8 Mb的EMRSA15参考基因组比对，平均错配率为0.12%。

血统验证

多年来，短串联重复序列（STR）一直作为鉴别动物和了解后代与父母亲缘关系的遗传标志物。一般来说，我们需要多个标志物，来提高鉴别真实父母的可能性。目前，STR的使用正逐渐被SNP所取代，后者具有更高的鉴别能力。MiSeq系统的多重分析能力和通量可实现更快的血统研究，提供通过微卫星测序所需的长读取，同时对血统SNP进行基因分型。

RAD-Seq

限制性位点关联的DNA标志物测序（RAD-Seq）是一种基因分型方法，可实现部分靶基因组的拷问（0.1% - 15%）。与拷问每个碱基对不同，它通过筛查两侧带有特定限制性核酸内切酶的识别位点的DNA短片段（RAD标签）进行遗传变异分析。MiSeq系统能够对RAD标签测序，以便发现SNP，从而实现进一步混合分组分析中合并群体的基因分型，以及精细规模定位中个体的多重基因分型，以便将基因型与表型相关联。

新试剂支持更多的农业基因组学应用

扩增子筛查和定向转录本测序在人类基因组学研究中日益增多，这要归功于新一代测序仪，如Illumina HiSeq® 系统，它能够提供在数日内有效开展这些应用所需的通量。可在MiSeq系统上支持这些研究的TruSeq试剂进一步拓宽了农业基因组学应用，如今这些应用都可用这台小巧经济的系统来开展。

扩增子测序

扩增子测序可用于转基因（GMO）检测，以确保存在预期序列，以及不存在非预期序列；也能确定遗传纯度，以评估同一批种子中所有种子的相似度；或确定可用于鉴定物种的DNA“条码”，。MiSeq系统和TruSeq Custom Amplicon让这些研究能够更快捷更经济地开展。利用MiSeq系统，96个目标中96个样品的扩增子测序可在3天内完成；比用毛细管电泳测序相同样品要快10倍以上（3-4周）。

定向转录本测序

研究转录组的相关子集可提供新颖的视角，让我们深入了解发育过程中、疾病和压力状态下表达水平的改变。转录组研究可鉴定新的转录本和测序改变。MiSeq系统可实现定向转录本测序研究，提供了以高的读取深度对样品进行多重分析的宽度，其耗时比毛细管电泳要少得多。

结语

MiSeq系统提供了快速的结果、简化的流程和极少的手工操作时间，让它成为多个农业基因组学测序应用中毛细管电泳的经济高效替代。由Illumina测序系统通用的TruSeq技术所推动，MiSeq还能开展小型基因组de novo测序和重测序，带来高质量的数据，其中无错误读取的产量最高，高于Q30的碱基检出最多。在其小巧的体积内，MiSeq整合了簇生成、扩增、测序和数据分析，可轻松放入当今的农业基因组学实验室，带来了的一站式的单台仪器解决方案。

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