Nature:蛋白质互作的筛查系统(下)

【字体: 时间:2012年04月13日 来源:生物通

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  哺乳动物细胞蛋白质与蛋白质相互作用陷阱(mammalian protein-protein interaction trap,MAPPIT)系统是最高通量的哺乳动物筛选系统之一。该系统利用的并非是酵母转录因子,而是一种哺乳动物细胞因子受体。

  

生物通报道  随着越来越多的蛋白质相互作用被发现,研究人员正在寻找新的途径查询这些数据,理解相关内容之间的联系。

上接:Nature:蛋白质互作的筛查系统(上)

哺乳动物细胞蛋白质与蛋白质相互作用陷阱(mammalian protein-protein interaction trap,MAPPIT)系统是最高通量的哺乳动物筛选系统之一。该系统利用的并非是酵母转录因子,而是一种哺乳动物细胞因子受体。这种细胞因子受体同样被分割,当重建时才能够传导信号。2009年,比利时法兰德斯跨学院生物技术研究所(VIB)的网络生物学家Jan Tavernier描述了更高通量的MAPPIT系统,在这一系统中可编码与细胞因子受体片段连接的潜在互作伴侣蛋白的质粒被分别置于小孔中保存。实验之初,将可表达可与选择性“诱饵”连接的细胞因子受体片段的细胞加入到小孔中。当互作发生时,信号就会激活发光荧光素酶。

利用多孔板,花费约2,000(2600美金)就可以筛选一个针对人类ORFeome(一整套克隆蛋白编码开放阅读框)的诱饵蛋白。Tavernier表示希望能够在今年晚些时候实现在微芯片上运行MAPPIT。微型化检测可将成本降低到100,并在1星期内检测针对100个诱饵的ORFeome。

Tavernier说以这样的高通量和成本,各种新实验将变得可行,而不再将筛查局限于酵母细胞。“你开始在适当的物种中绘制完整的互作组,”Tavernier说。此外,Tavernier还计划用药物或有毒化合物来处理的细胞比较互作组的变化。他希望能将这一技术商业化,并正与Vidal及其他科学家们一起致力利用MAPPIT 和 Y2H检测绘制人类蛋白质互作。

LUMIER也是相对高通量的系统,可用于检测是否存在受药物、激素或其他添加物影响的特异互作。在这些检测中,两种蛋白被用于瞬时转染细胞。一种蛋白连接上称之为FLAG的亲水性肽。潜在的互作伴侣蛋白连接上荧光素酶。细胞裂解,FLAG标记的蛋白被捕获,利用它们发出的荧光来检测互作伴侣蛋白的存在。

蛋白片段互补测定(PCA)既可以在酵母细胞也可以在哺乳动物细胞中进行,主要取决于重构的大量“报告子”,通常是酶或荧光蛋白。因为报告子能够在整个细胞发送信号,在它们自然发生的地方就可以检测到互作。

在2009年发布的论文中,Vidal, Wanker和其他研究人员描述了Vidal在高通量筛选中评估发现的蛋白质互作的实证框架。事实上,这意味着重复实验采用了不同类型的检测,并与对照组结果进行了比较。阳性对照是从文献中仔细挑选出的大约100种已确立的互作。阴性对照是100个随机指定的配对蛋白,它们过去从未发现能相互结合。对检测条件进行调整以提高对阳性对照的检测,而避免检测随机互作。

作为《自然方法》(Nature Methods)杂志上提出的框架的一部分,来自互作研究的结果应该在不同类型的检测中进行确证。越多的方法发现相同的互作,研究人员就越能确信得到的结果。不过总体上,这些方法也只能检测大约70%的阳性参考设置。

高通量实验并不是唯一鉴别蛋白质间互作的途径。还有几种数据库,例如生物学相互作用通用库(Biological General Repository for Interaction Datasets, BioGRID)和IntAct都搜集了文献上发布的,从小型和高通量实验,以及其他分析推断的预测互作中挑选出的互作列表。欧洲生物信息研究所蛋白质组学服务协调员Sandra Orchard说然而这一列表甚至远未接近完成,他帮助开发了最小的信息标准辅助分享和评估互作数据。“如果能观察到30%的酵母互作组,我们就是非常幸运了,”她说。对于人类互作组,她估计数字会小于10%,其中包括已发表但还未被数据库收录的互作。

下接:Nature:令人迷乱的蛋白质互作

(生物通:何嫱)

生物通推荐原文摘要:

Proteomics: The interaction map

As increasing numbers of protein–protein interactions are identified, researchers are finding ways to interrogate these data and understand the interactions in a relevant context.


 

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